气相色谱法同时测定功能接装纸13种酸味剂

＊倪和朋 张震 冯懂懂 邹琦 王娜 郭丁荣

（红塔烟草（集团）有限责任公司玉溪卷烟厂 云南 653100）

酸味添加剂在食品中可作为香味辅助剂，广泛应用于食品体系调香。许多酸味剂都能得益于特定的香味，如酒石酸可辅助葡萄的香味，磷酸可辅助可乐饮料香味等。酸味剂亦能平衡食品体系的风味，修饰蔗糖或甜味剂的甜味。适宜的酸值可以抑制许多有害微生物的繁殖，抑制不良的发酵过程，并可达到酸型防腐剂的效果，减少高温灭菌时间,避免高温对食品风味产生的不利影响[1]。现行的酸味剂检测标准有GB 5009.28-2016《食品安全国家标准食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》[2]，GB 5009.121-2016《食品安全国家标准食品中脱氢乙酸的测定》[3]，GB 5009.157-2016《食品安全国家标准食品中有机酸的测定》规定了食品中酒石酸、乳酸、苹果酸、丁二酸、富马酸和己二酸的测定[4]。

在卷烟行业中，为提升卷烟的抽吸品质和满足消费者的感官需求，近年来在卷烟接装纸上也逐渐添加一些酸味剂。但酸味剂的添加量和种类对感官品质的稳定性有较大影响，因此卷烟企业逐渐重视对接装纸酸味剂的监控。目前各企业烟用酸味接装纸是采用人工味觉品尝来实现对其质量稳定性的监控，而这种方法带有一定的主观性，缺少量化标准，存在诸多弊端，整个烟草行业也亟需一种可量化、稳定的检测方法，形成统一标准方法。

随着现代分析仪器的发展与应用，多种检测技术如分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱法、离子色谱、电泳法都被广泛应用到酸味剂的检测[5-11]。气相色谱法具有操作简便、灵敏度高、分析时间短等优点，在检测时应用较为广泛[12]。本试验对非挥发酸测定的前处理条件进行优化，建立了气相色谱同时测定功能性接装纸中13种非挥发酸的检测方法，并对部分品牌接装纸中酸味剂的种类及其含量进行了检测分析，为接装纸中酸味特征成分的质量监测和品质控制提供依据。

1.实验部分

(1)仪器与设备

电子天平（EL-204，梅特勒-托利多仪器有限公司），电热恒温水浴锅（HZ-2，北京市医疗设备总厂），低温冷却液循环泵（DLSB-10/25，郑州凯鹏实验仪器有限公司），循环水多用真空泵（SHB-3，郑州杜甫仪器厂），气相色谱仪（Agilent6890，安捷伦科技有限公司）。

(2)材料与试剂

接装纸（（3.0）41.5g×76mm×2500m）（酸味功能性接装纸，安徽集友纸业包装有限公司玉溪接装纸制造有限公 司）；无水乙醇（色谱级，天津市富宇精细化工有限公司）；甲醇（色谱级，天津市德恩化学试剂有限公司）；硫酸（AR，洛阳昊华试剂有限公司）；二氯甲烷（色谱级，天津市德恩化学试剂有限公司）；无水硫酸钠（AR，天津市德恩化学试剂有限公司）；氯化钠（AR，天津市德恩化学试剂有限公司）；己二酸（AR，郑州派尼化学试剂厂）；草酸（AR，上海华彭实业有限公司）；丙二酸（＞98%，FLUKA公司）；丁二酸（＞98%，百灵威）；月桂酸（＞98%，FLUKA公司）；十三碳酸（＞98%，Sigma）；苹果酸（＞98%，百灵威）；十五酸（＞99%，FLUKA公司）；棕榈酸（＞98%，Sigma）；柠檬酸（＞99%，FLUKA公司）；硬脂酸（＞99%，FLUKA公司）；油酸（＞98%，百灵威）；亚油酸（＞98%，FLUKA公司）；亚麻酸（＞98%，FLUKA公司）。

(3)试验方法

①溶液的配制

酯化剂：在冰水浴搅拌的条件下，将适量浓硫酸缓慢加入一定量的无水甲醇中，搅拌均匀，配置成10%的H2SO4-CH3OH溶液，保存备用。

内标溶液：精确称量0.6000g己二酸至100mL容量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至刻度，得到浓度为6.0000mg/mL的己二酸-甲醇内标溶液。

标样储备液：分别称取草酸0.5000g，丙二醇0.1142g，丁二醇0.0172g，十三碳酸0.0173g，苹果酸1.8043g，十五酸0.0122g，棕榈酸0.1457g，柠檬酸0.4071g，硬脂酸0.0565g，油酸0.0457g，亚油酸0.1085g，亚麻酸0.1100g至50mL的容量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至刻度。

②样品前处理

用粉碎机将接装纸粉碎，准确称取3.00g粉碎后接装纸，置于100mL圆底烧瓶，准确加入一定体积的10% H2SO4-CH3OH溶液，加入1mL己二酸内标溶液，在一定温度下进行水浴回流，冷却至室温后取回流液体10mL于100mL分液漏斗，加入20mL饱和食盐水混匀，加入10mL二氯甲烷萃取，重复萃取一定次数，合并萃取液，并加入3.5g无水硫酸钠干燥过夜。取适量萃取液经0.45μm有机滤膜过滤至色谱瓶，待气相色谱进样分析。

③气相色谱进样条件

色谱柱：HP-INNOWAX（30m×0.25mm×0.25μm）；载气：氦气；柱流速：1.2mL/min（恒流模式）；平均线速度：29.134cm/sec；进样口温度：280℃；分流比：5:1；程序升温：色谱柱初始温度50℃（保持2min）以5℃/min升温至180℃（保持10min），再以6℃/min升至220℃（保持10min）；进样量：1.0μL；检测器：FID；检测温度：280℃；氢气：40mL/min；空气：450mL/min；尾吹：15mL/min。

2.结果与讨论

(1)非挥发酸的标准工作曲线

分别取多元酸标准储备溶液0.2mL、0.5mL、2mL、4mL、5mL、8mL、10mL于100mL圆底烧瓶中，各加入1.0mL己二酸内标溶液和40mL 10% H2SO4-CH3OH溶液，水浴80℃回流2h。取回流液体10mL于100mL分液漏斗中，加入20mL饱和食盐水混匀，加入10mL二氯甲烷萃取，重复萃取3次，合并萃取液，加入3.5g无水硫酸钠干燥过夜后取适量萃取液经0.45μm有机滤膜过滤至色谱瓶，并利用气相色谱进样分析。

以各多元酸峰面积与内标（己二酸）峰面积之比为横坐标，以各多元酸浓度与内标（己二酸）浓度之比为纵坐标绘制标准曲线，根据保留时间定性、内标法定量原理得到各种酸的回归方程及其相关参数如表1所示。结果表明，13种非挥发酸的线性良好，相关系数均在0.999以上，检出限为0.10～0.16mg/mL，定量限为0.32～0.53mg/mL，达到检测标准。

表1 13种非挥发酸的回归方程、决定系数

(2)单因素试验分析结果

①酯化温度的影响

酯化温度对接装纸中非挥发酸含量测定的影响：固定酯化时间为120min，料液比（样品:酯化剂）为1:12，二氯甲烷萃取次数为3次，分别设置酯化温度为60℃、70℃、80℃、90℃、95℃进行试验。

实验结果如表2所示，随着酯化温度的升高，非挥发性酸的测定值先增高再降低。温度在一定程度上升高，提高了反应的进行，当酯化温度为90℃时，非挥发酸总量最高，温度继续升高后，非挥发酸总量会有所下降，这可能是酯化温度过高导致酯化后非挥发酸的衍生物挥发程度变高，因此确定90℃为最佳酯化温度。

表2 不同酯化温度下接装纸中非挥发酸含量的测定分析结果

②料液比的确定

料液比对接装纸中非挥发酸含量测定的影响：固定酯化时间为120min，酯化温度为80℃，二氯甲烷萃取次数为3次，分别按照样品：酯化剂=1:8、1:10、1:12、1:14、1:16的比例进行实验（即分别取酯化剂24mL、30mL、36mL、42mL、48mL进行酯化实验。

实验结果如表3所示，随着料液比的增大，非挥发酸总量呈现先升高后趋于稳定的趋势。料液比从1:8增加到1:12的过程中，随着酯化剂用量的增加，样品的甲酯化程度越完全，非挥发酸总量越高。料液比大于1:12后，样品中非挥发酸的甲酯化程度已基本达到最大，非挥发酸总量也基本保持不变，因此确定实验的最佳料液比为1:12。

表3 不同料液比下接装纸中非挥发酸含量的测定分析结果

③酯化时间的确定

酯化时间对接装纸中非挥发酸含量测定的影响：固定酯化温度为80℃，料液比（样品:酯化剂）为1:12，二氯甲烷萃取次数为3次，分别设置酯化时间为100min、110min、120min、130min、140min，5个时间进行试验。

实验结果如表4所示，随着酯化时间的增加，非挥发酸的总量呈现先增加后略有下降的趋势，这是因为随着酯化时间的增加，甲酯化过程进行的越彻底，当样品完全酯化（酯化时间为110min）后，酯化时间的增加，反而会影响非挥发酸甲酯化的过程，增加实验成本。因此，实验的最佳酯化时间为110min。

表4 不同酯化时间下接装纸中非挥发酸含量的测定分析结果

④萃取次数的确定

萃取次数对接装纸中非挥发酸含量测定的影响：固定酯化时间为120min，料液比（样品:酯化剂）为1:12，酯化温度为80℃，分别设置二氯甲烷萃取次数为1次、2次、3次、4次、5次进行试验。

结果如表5所示，随着萃取次数的增加，非挥发酸总量呈现先升高后趋于稳定的趋势，这是因为萃取次数可直接影响萃取效率，萃取次数越多，即萃取液体积越多，酯化后非挥发酸衍生物萃取的越彻底，当萃取次数达到3次后，溶液中的非挥发酸已基本被萃取完全。因此确定萃取次数3次为最佳萃取次数。

表5 不同萃取次数下接装纸中非挥发酸含量的测定分析结果

(3)加标回收率

用粉碎机将接装纸粉碎，准确称取3.00g粉碎后接装纸，置于100mL圆底烧瓶，添加已知量的混合非挥发酸溶液，按照2.1节方法进行分析。结果如表6所示，8种非挥发酸的回收率在81.10%～118.54%之间，回收率较高，表明该方法适用于接装纸中非挥发酸含量的测定。

表6 8种非挥发酸的加标回收率

(4)实际样品接装纸中非挥发酸测定结果

通过变量控制法分别对单因素进行考察，最终确定前处理最优化方案，即酯化温度为90℃，料液比为1:12，酯化时间为110min，萃取次数为3次。并以此做样品前处理，对样品中非挥发酸进行测定分析，结果如表7、图1所示，结果表明，样品中共检测出6种非挥发酸，其中丁二酸含量为0.1mg/g，苹果酸含量为2.25mg/g，棕榈酸含量为0.12mg/g，柠檬酸含量为0.40mg/g，硬脂酸含量为0.13mg/g，亚油酸含量为0.36mg/g。试验表明，优化后比前处理方法适合实际样品的检测。

表7 红塔山（细支传奇）接装纸中非挥发酸含量的测定分析结果

图1 18红塔山（细支传奇）接装纸中非挥发酸总离子流图