当归多糖对STZ诱导的糖尿病大鼠糖化血清蛋白、免疫反应及氧化应激的影响∗

孟祥云，汪永锋，郭树明，杨丽霞，张之弘，王永胜

1甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050；2甘肃中医药大学；3甘肃省中医药研究院；4张掖市甘州区人民医院急诊科

研究显示［1］，2型糖尿病患者血循环中糖蛋白、急性期反应物及白细胞计数均明显增高；进一步研究发现，炎性标志物能够反映和预测2型糖尿病及其代谢综合征的发生。2型糖尿病及其并发症患者表现出全身性、低度性、慢性的炎症反应。因此2型糖尿病与免疫、炎症有着密切的联系。同时研究显示，氧化应激贯穿糖尿病的产生和发展过程中，起到重要作用［2］。而机体异常免疫应答又能够产生大量自由基，对胰岛β细胞具有极大的破坏作用。

当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels属伞形科植物，以干燥根入药，有补血、和血，调经止血，润肠滑肠作用［3］。现代药理学研究发现，当归中含有多种成分，主要包括挥发油、有机酸、多糖以及黄酮类化合物，具有广泛的生物活性，如调节免疫、保护肝脏［4］、抗动脉粥样硬化［5］、抗肿瘤［6］、抗炎镇痛［7-8］等。研究发现，当归多糖（angelica polysaccharides，AP）能够有效降低血糖，调节脂代谢［9-10］。本研究通过链脲霉素（strep-tozotocin，STZ）诱导建立2型糖尿病大鼠模型，观察当归多糖在2型糖尿病中糖化血清蛋白（glycated serum protein，GSP）、免疫反应及抗氧化的活性。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级SD大鼠60只，体质量（200±20）g，购自甘肃中医药大学动物实验中心，实验动物许可证号：SCXK（甘）2015-0002，实验单位使用许可证号：SYXK（甘）2015-0005。饲养条件：大鼠饲养于甘肃中医药大学SPF级动物实验室，温度18～26℃，相对湿度40%～70%，普通饲料适应性喂养1周。

1.2 试药及仪器当归多糖（纯度98%，陕西慈缘生物技术有限公司提取，批号：CY170321）；吡格列酮片（广东华南药业集团有限公司，批号：H44025019，规格：30 mg/片）；链脲佐菌素（SIGM公司，批号：51254975，规格：5 mg/瓶）；生理盐水（华润双鹤药业股份有限公司，批号：H11021635，规格：250 mL/瓶），用蒸馏水稀释浓度为0.7 mg/mL的注射液，保存条件要避光；糖化血清蛋白ELISA测定试剂盒（上海信帆生物科技有限公司，批号：20171204341）；免疫球蛋白免疫球蛋白A［（immunoglobulin A，IgA）、免疫球蛋白G（immunoglobin G，IgG）、免 疫 球 蛋 白M（immunoglobin M，IgM）］、ELISA测定试剂盒（上海信帆生物科技有 限 公 司，批 号：20171206102、20171205201、20171206103）；总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、一氧化氮（Nitric Oxide，NO）生化测定试剂盒（南京建成生物公司，批号：20171218、20171214）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）生化测定试剂盒（苏州科铭生物，批号：20171218）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）ELISA测定试剂盒（上海信帆生物科技有限公司，批号：20171205125、20171204136）。352型酶标仪［芬兰（Labsystems Multiskan MS）公司］；AC8型洗板机［芬兰（Thermo Labsystems）公司］；TG16W型微量高速离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）；GNP-9080型隔水式恒温培养箱（苏州柏兆科学仪器有限公司）；移液器（吉尔森P型移液器公司，型号：P2、P10、P20、P100、P200、P1000）。

1.3 实验方法

1.3.1 试药制备 当归多糖溶液的配制：分别称取10、20、40 mg当归多糖，分别溶于100 mL双蒸水溶解，混匀，配制成低、中、高浓度。4℃冰箱保存，使用前室温平衡30 min以上。吡格列酮溶液的配制：吡格列酮100 mg，溶入100 mL蒸馏水，于4℃冰箱保存，使用前室温平衡30 min以上。

1.3.2 造模及分组 选取10只大鼠为空白组（N），其余大鼠以专用的高糖高脂饲料饲养8周，以25 mg/kg STZ在大鼠左下侧腹腔注射，连续注射1周，尾静脉采血检测大鼠血糖值≥13.9 mmol/L确定模型成功，如未成功的大鼠追加注射1次STZ（12.5 mg/kg）。按照随机数字表法进行分组，分为模型组（M）、当归多糖低剂量组（APL）、当归多糖中剂量组（APM）、当归多糖高剂量组（APH），吡格列酮组（P），每组10只。

1.3.3 给药方法 药物剂量换算按“人与大鼠体表面积换算方法”进行换算给药。当归多糖低、中、高剂量组以当归多糖溶液灌胃，浓度依次为100、200、400 mg/kg；吡格列酮组以吡格列酮溶液10 mg/kg灌胃；空白组和模型组灌服相同体积的生理盐水，剂量1 mL/100g。每日1次，连续灌胃4周。

1.4 指标检测

1.4.1 GSP、IgA、IgG、IgM、T-AOC、MDA、SOD、GSH-PX、NO水平 末次给药后，禁食不禁水10 h，心脏负压采血，4℃，4000 r/min离心5 min收集血清，分别按照试剂盒说明书中的操作步骤，检测血糖指标GSP［11］、血清中免疫指标IgA、IgG、IgM，氧化指标T-AOC、MDA、SOD、GSH-PX、NO水平。

1.4.2 胰岛计数 大鼠采血后处死，取出胰腺组织，置于液氮罐冷冻固定后放入-80℃储存。用4%多聚甲醛固定后保存的组织、石蜡包埋固定、切片后，经常规HE染色，光学显微镜下观察切片胰岛的染色情况和形态及分布情况，每张切片随机选取5个200倍镜下进行胰岛计数并拍照。

2 结果

2.1 糖化血清蛋白模型组大鼠较空白组糖化血清蛋白显著升高（P＜0.01），经药物干预后，吡格列酮组及当归多糖各剂量组糖化血清蛋白水平显著降低（P＜0.01），并且与当归多糖剂量呈负相关。见图1。

图1 各组大鼠糖化血清蛋白比较

2.2 免疫因子水平大鼠血清中免疫球蛋白IgA、IgG、IgM含量，与空白组比较，模型组大鼠血清中3种免疫球蛋白含量均显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，当归多糖中、高剂量组大鼠血清中3种免疫球蛋白含量均显著增加（P＜0.01）。见图2。

图2 各组大鼠血清IgA、IgG、IgM含量比较

2.3 抗氧化因子水平与空白组比较，模型组大鼠血清中T-AOC、SOD活性和GSH含量均有明显下降，但MDA、NO的含量显著上升（P＜0.01）。除当归多糖低剂量组SOD活性无明显变化外（P＞0.05），吡格列酮组与当归多糖高、中剂量组均能明显增加糖尿病大鼠血清中T-AOC、SOD的活性和GSH含量，并可有效降低MDA、NO含量（P＜0.01）。当归多糖的作用呈现剂量依赖性。见图3。

图3 各组大鼠血清中T-AOC、SOD、MDA、GSH和NO含量比较

2.4 胰岛计数结果与空白组比较，模型组胰岛破坏严重，胰岛数目减少（P＜0.01）；与模型组相比较，比格列酮组和当归多糖各剂量组有新生胰岛分布，胰岛数目增加（P＜0.01）；并且当归多糖高剂量组和比格列酮组新生胰岛数目增加明显（P＜0.01）。新生胰岛随着当归多糖浓度的上升数目逐渐增加。见图4。?

图4 各组大鼠胰岛计数比较

3 讨论

糖尿病患者由于长期高血糖、高血脂及蛋白质紊乱造成多系统损伤，如眼、肾、心脏、血管等发生慢性病变，以至于功能减退甚至衰竭。目前治疗糖尿病主要是通过长期服用西药或注射胰岛素来控制血糖［12］。常用的降糖药物有磺脲类、格列奈类［13］、双胍类、α-糖苷酶抑制剂［14］、胰岛素增敏剂类等药物。中医药治疗该病能兼顾各证，整体性和辨证性尤为突出。尤其近年来植物多糖在糖尿病方面的研究备受关注，植物多糖是一类由糖苷键连接起来的醛糖或酮糖组成的高聚物。因此，本研究采用当归多糖干预STZ诱导的糖尿病大鼠，观察其对血糖、免疫调节及抗氧化活性的影响。

GSP不受血红蛋白变异或其他可促进红细胞更新因素的影响，对于治疗糖尿病疗效的评价、监控具有快速、灵敏、特异的特点［11］。因此，测定糖化血清蛋白，是治疗糖尿病患者血糖水平及用药监测的一项有意义的指标。免疫是机体对异己物持是进行识别、排除或消灭，对人体生理平衡起到维和保护功能。胰岛β细胞的损伤及胰岛素抵抗2型糖尿病发生、发展的主要发病机制［15］。免疫球蛋白是机体体液免疫重要的免疫效应分子，在机体初级免疫应答中，IgG是最持久、最重要的抗体，易透过毛细血管壁弥散到组织间隙中，发挥抗感染、中和毒素的作用。IgM是初次体液免疫反应最先产生的免疫球蛋白，主要分布于血流中，在早期防御中具有起较强的抗全身感染的作用。在对2型糖尿病及其并发症的研究中发现，持续的高血糖、高血脂会使糖基化蛋白质发生氧化、细胞浆内醛还原反应、儿茶酚胺分泌增多与氧化增强、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的合成不足等原因致使体内氧自由基增高，当产生率大于其消除率时就会产生氧化损伤。同时产生的大量活性氧自由基可直接损伤胰岛β细胞，破坏细胞内部线粒体结构，进而使胰岛β细胞凋亡，并且大量的活性氧可以影响胰岛素信号转导通路，对β细胞功能起到间接抑制作用。MDA是活性氧与多不饱和脂肪酸反应的产物，能准确反映机体受氧化应激损伤的程度［16］。拮抗NO是一类重要的活性氧分子，既有神经保护作用，又有神经毒性作用。但过高浓度的NO会使蛋白质、核酸遭到破坏，加速细胞线粒体的损伤，促进细胞调亡［17-18］。T-AOC的测定能够清楚地反映糖尿病患者抗氧化防御能力，并且能更好地反应抗氧化剂状态。SOD和谷胱甘GSH-PX是机体维持自由基平衡，间接反映机体抗氧化损伤和清除氧自由基的能力［19］。

本研究结果显示，当归多糖能显著降低糖尿病大鼠GSP水平、提高血清中免疫球蛋白IgA、IgG、IgM含量，能减缓糖尿病大鼠自身免疫反应的程度；增强糖尿病大鼠血清中SOD的活性，增加TAOC、GSH含量；明显降低MDA、NO的含量。同时，通过胰岛计数显示，当归多糖各剂量组能够增加糖尿病大鼠新生胰岛细胞。因此从本次实验结果观察，当归多糖能减缓2型糖尿病大鼠自身免疫反应程度，缓解氧化应激反应，从而降低糖化血清蛋白，改善胰岛细胞损伤，对大鼠胰腺组织有一定的修复作用。但其作用的一系列信号通路及作用靶点还需要进一步研究证明，以便更好地开发该药。