不同参数Er:YAG激光照射对人牙周膜细胞粘附和增殖能力的影响

王丽霞 申 静 曲佳菲 王明辉

牙周炎是由菌斑微生物引起的以牙周支持组织破坏为主的慢性感染性疾病[1]，是成年人牙齿脱落的主要原因之一[2]。牙周非手术治疗的主要目标是彻底清除牙周袋内的菌斑、牙石、病变牙骨质等，从而去除感染组织，以防止疾病进展、改善附着水平，并争取适当的牙周组织再生，以维护牙周健康。龈下刮治和根面平整术（scaling and root planning，SRP）是目前牙周非手术治疗最经典、最有效的方法，通常通过手动或超声器械来完成[3]，但仍存在一定的局限性：其操作具有一定难度，术后根面敏感，机械治疗后形成的含有细菌、细菌内毒素和病变牙骨质的玷污层可能会阻碍细胞与根面的重新附着，从而不利于牙周组织的愈合等[4，5]。

Er：YAG激光属于中红外线激光，波长2.94μm，与水（3.0μm）和羟基磷灰石的OH-（2.8μm）对红外线的吸收峰值相近，具备在水和羟基磷灰石中高度吸收的良好特性，对软硬组织均有切割效果；且能量吸收主要集中在几微米厚的组织表层，仅能穿透约0.01mm的牙体组织。Er:YAG激光较其它激光最为显著的优点是，在有效去除根面牙石的同时不对邻近组织造成热损伤，其能在尽量减小对软硬组织损伤的情况下进行牙周治疗[6]。国外虽有大量关于Er:YAG激光在牙周治疗领域的体内外研究，但所选用的激光型号、参数设置、操作时间、照射角度等都不尽相同，得出的结论也不一致。国内关于不同参数Er:YAG激光照射对牙周炎患牙根面形态影响的研究报道尚不多见。

本研究以新鲜拔除的重度牙周炎患牙为研究对象，分别采用单纯超声刮治，超声联合手工刮治以及超声联合手工刮治辅以不同参数Er:YAG激光照射对根面进行处理，通过评估人牙周膜细胞接种于各组样本后的粘附、增殖情况，初步探讨Er:YAG激光用于牙周非手术治疗时的合适治疗参数，以期为该激光在牙周炎临床治疗中的应用提供一定的理论基础依据。

资料和方法

1.主要实验材料和仪器：DMEM培养基（Gibco，美国），CCK-8试剂盒（Solarbio，中国），Fotona双波长激光（欧洲之星公司，斯洛文尼亚），Gracey刮治器（Hu-Friedy，美国），超声治疗仪（赛特力P5，法国），CO2恒温培养箱（Thermo Forma，美国），扫描电子显微镜（日立SU8010，日本），生物显微镜（奥林巴斯 CH20，日本），酶标仪（Mulliskan MK3，芬兰）

2.研究对象：收集天津市口腔医院口腔颌面外科门诊因诊断为重度牙周炎而拔除的单根前牙及前磨牙90颗（经天津市口腔医院生物医学伦理委员会批准，批准号：2017BSZD04），随机分为9组，每组10颗离体牙；同时收集正畸减数拔除的健康单根前磨牙10颗，作为空白对照组（Control组）。蒸馏水冲洗清除血渍，去除表面软组织，避免损伤牙根面，并在37℃的生理盐水中保存，准备进行实验处理。纳入标准：①邻面探诊深度及附着丧失＞6mm，②IIIII°松动，③近6个月内未进行过牙周治疗、未服用抗生素，④未进行过根管治疗。排除标准：①患牙根面有龋坏或结构异常，②患有全身性疾病，③吸烟患者。

3.实验分组及样本制备：Control组：10颗因正畸拔除的健康离体牙，采用手术刀片刮除牙周膜。90颗重度牙周炎离体牙随机分为9组：Ultra组（单纯超声刮治）：使用超声治疗仪进行根面处理，重度牙周炎患牙10颗。Gracey组（超声联合手工刮治）：使用超声波治疗仪和Gracey刮治器进行根面处理，重度牙周炎患牙10颗。Er：YAG组（超声联合手工刮治辅以激光照射）：使用超声治疗仪、Gracey刮治器以及Er:YAG激光进行根面处理，根据不同脉冲能量分为7个亚组（Er 40、Er 60、Er 80、Er 100、Er 120、Er 140、Er 160），分别为40mJ/P、60mJ/P、80mJ/P、100mJ/P、120mJ/P、140mJ/P、160mJ/P的激光处理（频率10Hz，功率1W，水/气：50%，与牙面呈15～20°角），每组重度牙周炎患牙10颗。所有离体牙根面的冲洗和刮治处理均由一名操作者完成。治疗结果检验的标准是用尖锐探针探查及肉眼观察牙根面平整光滑，没有存在牙结石的临床证据。在水冷却下使用高速手机从邻面釉牙骨质界下2mm处切取面积5×5mm2、厚度1mm的根片用于后续实验。

4.人牙周膜细胞培养：人牙周膜取自天津市口腔医院口腔颌面外科门诊因正畸拔牙的患者。患者年龄12到15岁。所选牙无龋坏、根尖周炎和牙周炎。在不含血清的细胞培养液润湿下用手术刀片刮取根中三分之一的牙周膜。将刮取的牙周膜组织均匀铺于无菌的培养瓶中，加入DMEM培养基，置于CO2恒温培养箱中孵育。显微镜下观察细胞生长至瓶底80%～90%时，胰酶消化传代。取4～6代细胞用于实验。

5.扫描电子显微镜观察人牙周膜细胞在各组样品的粘附生长情况：人牙周膜细胞以5×104浓度接种到24孔板每组样品上，每组4根片，继续培养24h。置于2.5%戊二醛固定4小时，随后用0.1M磷酸缓冲液清洗3次，每次15～30分钟，无水乙醇配制梯度乙醇溶液（30%、50%、70%、90%和100%）脱水，乙酸异戊酯置换两次后进行CO2临界点干燥，最后利用粘接剂将样品固定在样品台上，使用离子溅射仪进行镀金以提高导电性，准备扫描电镜观测牙周膜细胞在根片表面的粘附生长情况并拍照。

6.CCK-8法检测细胞增殖能力：人牙周膜细胞以每孔5×104浓度接种到4块48孔板的所有样本上，每个时间点每组4根片。将培养板移入培养箱中，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。分别在接种细胞后的第1，3，5，7天，取出一块48孔板，每孔加入配制好的CCK-8溶液40ul，37℃培养箱中继续孵育4h，终止培养，小心吸尽孔内培养上清液。选择450nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值（OD值）并记录结果。

7.统计学分析：采用GraphPad Prism 8软件进行统计学分析，结果以χ±s表示，进行方差齐性检验，各组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05具有统计学意义。

结 果

1.人牙周膜细胞的体外培养：牙周膜组织块接种后3～6天可见有细胞游离出来，但尚不能分辨细胞结构；接种20天后，可见大量成纤维细胞向四周呈放射状生长；第4代细胞呈放射状或旋涡状生长，形态与原代相同：镜下呈长梭形，胞体丰满，胞质均匀，细胞透明度大，细胞核圆形或卵圆形，核仁清晰（图1）。

图1 人牙周膜细胞传代培养第4代（倒置显微镜 ×40）

2.扫描电子显微镜观察各组根面人牙周膜细胞粘附生长情况：不同牙周治疗方法处理后各组根片上均可看到人牙周膜细胞附着。Control组、单纯超声刮治Ultra组仅可观察到圆形细胞粘附。超声联合手工刮治Gracey组、超声联合手工刮治辅以激光照射Er 40组及Er 60组可见细胞呈长梭形，伸出伪足明显。超声联合手工刮治辅以激光照射Er 80组及Er 100组细胞亦伸出伪足但不明显。超声联合手工刮治辅以激光照射Er 140组及Er 160组细胞粘附数量较少，且出现皱缩现象（图2）。

3.CCK-8法比较各组根面人牙周膜细胞增殖情况：不同牙周治疗方法处理后各组内人牙周膜细胞生长增殖情况比较如图3，与第1天比较，第3天、5天、7天Control组、超声联合手工刮治Gracey组、超声联合手工刮治辅以激光照射Er 40组、Er 60组、Er 80组、Er 100组、Er 120组及Er 160组根面附着细胞数均呈上升趋势，而单纯超声刮治Ultra组及超声联合手工刮治辅以激光照射Er 140组与第5天比较，第7天时根面附着细胞数增加不明显。

图3 各组内根面人牙周膜细胞增殖情况比较（CCK-8法）

各组间比较如图4，第1天，各组细胞均存活，且各组之间无差异。在第3天、5天时，单纯超声刮治Ultra组附着于根面细胞数明显高于其他各组。第7天时，该组根面附着细胞减少；而超声联合手工刮治Gracey组、超声联合手工刮治辅以激光照射Er 40组及Er 60组附着于根面的细胞数明显高于其他各组；超声联合手工刮治辅以激光照射Er 40组附着于根面的细胞数略高于超声联合手工刮治Gracey组，但没有统计学意义。此外，超声联合手工刮治辅以激光照射Er 80组、Er 100组、Er 120组、Er 140组以及Er 160组之间没有明显的差异。

图4 各组间根面人牙周膜细胞增殖情况比较（CCK-8法）

讨 论

牙周组织再生是牙周治疗的主要目标之一，理想的结果是再生的高度组织化的胶原纤维可以重新牢固地附着在再生的牙骨质和牙槽骨上[7]。从牙根表面清除龈下微生物群和细菌内毒素是成纤维细胞迁移和附着的必要条件，而这通常是不可能通过机械治疗实现的。多项研究表明，CO2，Nd:YAG和Er:YAG激光可以提高牙根表面清创效率[8，9]。

本研究中发现人牙周膜细胞在牙根表面的增殖随Er：YAG激光能量的增高而增加，可能是由于Er：YAG激光处理后的根面表面粗糙度较高，增强了牙周膜细胞的粘附性。与我们的结果类似，多项研究表明，与机械清创表面相比，激光照射后表面上的成纤维细胞能够更快速地粘附和增殖[10]。亦有研究表明在一定程度上增加根面粗糙度，更有利于牙周膜成纤维细胞的附着，而不增加微生物的粘附[11]。Tsurumaki等[12]进一步实验证实，根面粗糙度的增加有利于纤维支架以及细胞的稳定粘附。Schwarz等[13]比较Er:YAG激光（160mJ，10Hz）和超声、手工治疗组对牙周成纤维细胞附着于牙周炎病变根面的体外研究发现，激光治疗组比超声和手工治疗组更能促进成纤维细胞在牙周炎病变根面的附着。本研究采用体外培养人牙周膜细胞接种于不同方法处理的牙根面上，采用扫描电子显微镜和CCK-8法观察其粘附和增殖能力。研究结果表明，与单纯超声刮治相比，超声联合手工刮治以及超声联合手工刮治辅以40mJ/P、60mJ/P的Er:YAG激光更有利于细胞的粘附与增殖，而且超声联合手工刮治辅以40mJ/P的Er:YAG激光组可能效果更好，但尚需要长期的基础和临床研究予以证实。

Er:YAG激光具有公认的抗菌作用，高效的牙结石清除能力，最小的周围硬组织损伤，并且更有利于细胞附着[14]，有望成为传统牙周非手术治疗的辅助手段之一。另一方面，应用Er：YAG激光增加牙根表面粗糙度可能导致菌斑滞留增加，因此，需要进一步的长期体外和临床研究，以评估细菌在Er：YAG激光照射的根面上定植的可能风险，这对维持长期的牙周组织健康至关重要。