苦参提取物防龋作用的动物实验研究

谢雪洁 吴泽钰 宋 洁 范文献 赵 今

龋病是全世界分布最广泛的细菌性慢性疾病之一，虽然随着社会经济的发展，近几年发病率有下降趋势，但其发病率仍处于较高水平，全世界约有80～90%的人们受其影响[1]。因此，探索安全可靠、经济有效的防龋措施迫在眉睫。苦参，一种我国应用广泛的传统中药，已被证实低毒且具有很高的药用价值，其主要活性成分苦参碱及氧化苦参碱的抗病毒、抗炎、抗心律失常、抗纤维化等药理作用也已得到充分证实[2～5]。S.mutans能在短期内建立龋病动物模型，在口腔真实的环境中模拟龋病的自然进程。本实验选用S.mut ans UA159，参照改良的大鼠龋病模型进行动物实验[6]，旨在以前期体外研究[7]为基础，进一步评估苦参提取物防龋的有效性及安全性。

资料和方法

1.主要仪器及试剂

洁净工作台（上海博迅，SW-CJ-2FD）；体式显微镜（Struers Minitom，丹麦）；37℃恒温摇床（恒温培养震荡仪，ZWY-240，上海）；CLSM（TCS-SP8，德国）；苦参（新疆医科大学天然药物研究重点实验室）；氯己定（源叶生物，LOT：J25J7Y16622）；紫脲酸铵指示剂（源叶生物，LOT：M06GS147307）；罗丹明B荧光染料（Solarbio，CAS:81-88-9）。

2.动物及饲料

雄性SPF-SD大鼠36只（新疆医科大学实验动物管理中心），Keyes 2000 diet（Trophic，Nantong，China），通过新疆医科大学伦理委员会审批。

3.致龋菌及培养基

S.mutansUA159标准株，购买于美国模式培养物集存库（american type culture collection，ATCC）脑心浸液培养基（brain heart infusion，BHI）：美国BD公司，Lot号：7075659。轻唾琼脂培养基（miltis salivarius agar base，MS）：青岛日水生物技术有限公司，Cat.No.10922。

4.实验分组

随机数表法将动物分为6组：2g/L、4g/L、8g/L苦参提取物干预的实验组；0.12%洗必泰（chlorhexidine，CHX）干预的阳性对照组（CHX）；无菌蒸馏水干预的龋病模型组（caries group，CA）以及不干预的空白对照组（Control）。

5.实验方法

（1）制备苦参提取物及S.mutans菌悬液：参照前期实验制得苦参提取物母液[7]，稀释至2g/L、4g/L、8g/L。选取S.mutans冻存菌株接种于BHI琼脂培养基，80%N2，20%CO2，37℃厌氧培养48h。观察菌落生长形态，随机取单个菌落涂片镜检，无污染且生化鉴定为纯培养后，相同培养条件下培养48h，取形态一致的菌落溶于BHI液体培养基，麦氏比浊法标定菌悬液浓度至106CFU/mL。

（2）建立动物模型：鼠龄21天，随机分组编号。22～24天，内源性细菌的抑制，饲以均匀混有氨苄西林钠（每2g配1000g普通饲料）的饲料及含青霉素钾（80万单位，1瓶配200mL生理盐水）的饮水。25天，口腔拭子检测内源性细菌的抑制情况。26～28天，用浸有饱和S.mutans悬液的棉签感染大鼠口腔（1mL/只）。29天，大鼠口腔拭子检测S.mutans的定植情况。鼠龄25天至实验结束，除空白对照组饲以普通饮食及饮水，其余组均饲以Keyes 2000 diet及5%蔗糖水。实验中期，每只大鼠鼠磨牙拍摄X线片，确认有低密度影像，证实龋齿形成后，继续下一步实验。

（3）药物口腔干预：30～50天，无菌棉签蘸取实验药液（1mL）至饱和，处理大鼠磨牙各牙面及口腔黏膜，剩余药液注入口内含漱，确保药液作用到位。每天干预2次（早晨10点及下午6点），每个象限15s，处理后禁食水2h，持续3周，干预始终由同一操作者完成，每天称重并记录大鼠的健康状况。

（4）标本采集：①唾液：鼠龄50天，腹腔注射0.2%硝酸毛果芸香碱（0.4mL/100g），采集大鼠唾液（100μL/只），稀释1000倍，取10μL均匀涂于BHI琼脂培养基（总菌菌落数）及MS琼脂培养基（S.mutans菌落数），80%N2，20%CO2，37℃厌氧培养12h，由两人分别进行菌落计数[11]，S.mutans水平＝（S.mutans菌落数/总菌落数）×100%。②颌骨标本：51天，水合氯醛麻醉下处死大鼠，无菌解剖颌骨，高压蒸汽灭菌锅中处理5min，清理颌骨上软组织，在0.4%紫脲酸胺溶液中染色12h。用0.15～0.2mm的线锯，沿颌骨近远中方向将牙列切开，体视显微镜下据Keyes评分法[8]评估大鼠磨牙龋损情况。紫脲酸胺渗入牙齿的大小和深度代表龋损的影响范围和严重程度。根据Keyes法，龋病分为四个等级:纯釉质龋（E）、轻度牙本质龋（Ds）、中度牙本质龋（Dm）和广泛牙本质龋（Dx）。Ds级龋损约占牙釉质至髓室顶间牙本质的1/4；Dm级龋损表示其间约1/4至3/4的牙本质受累，而超过3/4牙本质受累的龋损被标记为Dx级龋损。每颗磨牙光滑面E级龋损记分相加，作为这只大鼠光滑面的E级龋损总记分，同样方法进行窝沟E、Ds、Dm、Dx级龋损记分，所有评分均是双人双评。③主要脏器:采集心、肝、脾、肺和肾脏称重，计算脏器系数（脏器系数＝脏器重量/体重×100%）。④口腔黏膜组织:取每只大鼠同一部位口腔颊黏膜，4%多聚甲醛溶液固定24h，HE染色后显微镜观察。⑤牙磨片:用细砂纸将鼠磨牙制成厚约300μm的牙磨片，37℃下避光经罗丹明B荧光染料（0.1mmol/L）染色24h，CLSM下观察牙磨片的荧光激发情况。

6.统计学方法

采用SPSS26.0软件进行统计学分析，以α＝0.05作为组间比较的检验水准。计量资料用Shapiro-Wilk行正态性检验，符合正态分布计量资料用均数±标准差（±s）表示，不符合正态分布计量资料用P50（P25，P75）表示，分类资料用例数表示。①符合正态分布计量资料多组间比较，采用方差F检验，组间两两比较用LSD-t法。Mann-Whitney U两独立样本的非参数秩和检验。②不符合正态分布计量资料多组间比较用Kruskal-Wallis H检验，组间两两比较用Bonferroni矫正p法。③计量资料重复测量资料:采用重复测量方差模型，数据不满足球形假设条件采用Greenhouse-Geisser法校正。

结 果

1.S.mutans水平：如表1，组间菌落计数情况比较结果显示，BHI、MS、S.mutans水平差异均有统计学意义（P＜0.05）。且经两两比较:BHI指标为CHX组显著低于2g/L组，CA组显著高于其余组别；MS指标为CHX组显著低于2g/L组，CA组显著高于4g/L、8g/L、CHX和Control组；S.mutans水平指标为2g/L组、CA组显著高于4g/L组高于Control组、8g/L、CHX组。

表1 6组间菌落计数结果

2.Keyes记分：如图1，在龋病模型中，牙齿逐渐发展为龋损（被紫脲酸胺染成红色），CA组光滑面及窝沟明显有更广泛的颜色改变。如表2，各药物干预组与CA组相比，光滑面及窝沟的各级龋损评分均有所降低；8g/L组未检出Dm级龋损，CHX组未检出Dm级及Dx级龋损，这两组的光滑面龋评分、窝沟龋E级、Ds级、Dm级及Dx级评分与CA组均有显著统计学差异（P＜0.05）；4g/L苦参提取物组未检出Dx级龋损，其窝沟龋Dx级龋损与CA组有明显统计学差异（P＜0.05）。

表2 6组间Keyes评分结果

图1 龋齿Keyes评分及CLSM结果

3.体重、口腔黏膜HE染色及脏器系数：经过4周的实验，各组大鼠体重均呈上升趋势，Control组各时间点体重增幅最大。初始及第一周时，各组间差异无统计学意义，第二周开始至处死前均为Control组体重显著高于其余组别。其余组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。如图2。表4见6组间脏器系数比较时，肝脏系数差异有统计学意义（P＜0.05），Control组显著低于其余组别。心脏、肺脏、肾脏、脾脏指数各组间差异均无统计学意义（P＞0.05），见图3。如图4，各药物干预组口腔黏膜组织结构完整，细胞排列整齐，未见增生性改变、炎症反应和坏死等不良反应，与Control组无明显差异。

表4 6组间脏器系数比较

图2 各组大鼠的体重变化

图3 各组大鼠的脏器系数结果

图4 各组大鼠的口腔粘膜HE染色结果

4.牙磨片CLSM：如图1，CA组牙釉质连续性明显中断，牙磨片渗入的红色荧光强度与其余组相比较强；2g/L及4g/L苦参提取物组可见部分牙釉质裂纹，荧光强度较CA组有减弱，但并不明显；8g/L及CHX组牙釉质较连续，未见明显釉质裂纹，荧光强度较CA组明显降低。

讨 论

洗必泰是一种具有广泛抗菌活性的阳离子双肌类药物，对G+、G-和真菌都有杀菌作用，且抗菌效能高，临床常用其0.12%～2%溶液作为口腔疾病的预防和辅助治疗，常用作其他抗菌药物评价的阳性对照和金标准。故本实验选用0.12%洗必泰作为阳性对照组。然而长期洗必泰使用会导致味觉迟钝，口腔粘膜脱屑，牙齿、舌背着色和长期应用口腔菌群失调等。近年来，中草药防龋受到越来越多的关注和认可，众多学者已研究没食子[9，10]、青皮[11]、紫草素[12]等天然植物，充分证实了天然药物的防龋功效。

致龋菌对牙面的粘附是其致龋的前提，进而代谢食物中的碳水化合物，产生各种有机酸导致牙体硬组织脱矿，引起龋病的发生。在龋病的发展过程中，致龋菌合成胞内外多糖的能力和耐酸特性发挥着重要作用，胞内、外多糖可贮存能量供细菌利用，胞外多糖还有促进牙菌斑生物膜形成的作用[13]。因此，防龋的有效性通常体现在其对致龋菌及其生物膜生长、产酸、产糖及黏附的抑制方面。团队前期研究发现[7]，S.mutans在苦参提取物浓度为2g/L、4g/L和8g/L时，在对浮游菌产酸产生显著抑制作用；1g/L苦参能够显著抑制浮游菌合成水不溶性胞外多糖。牙菌斑生物膜是导致龋病发生的始动因子，因此在药物防龋方面，抑制S.mutans生物膜的形成和清除成熟生物膜具有重要意义[14]。然而本实验的旨在调节口腔微生态环境，完全清除S.mutans生物膜可能导致菌群紊乱，因此未设置16g/L浓度组，由于体内实验与体外实验相比，药物作用环境更为复杂，干扰因素也相对较多，据前期体外实验，1g/L组仅对浮游菌合成IEPS的抑制方面与阴性对照组有统计学差异，而对浮游菌生长、产酸、黏附、生物膜的生长及清除方面未见显著效果，因此本实验设置2g/L、4g/L、8g/L苦参提取物组作为实验药物组。

本研究中，2g/L组与CA组的BHI、MS及S.mutans水平指标均显著高于其余组，见表1；2g/L及4g/L组光滑面龋、窝沟龋E级、Ds级、Dm级Keyes评分与CA组无统计学差异（P＞0.05），但4g/L组Dx级评分与CA组有统计学差异（P＜0.05）。8g/L组及CHX组各级龋损评分与CA组均有统计学差异（P＜0.05），见表2。以上差异综合表明，2g/L苦参提取物抗龋效能欠佳；4g/L苦参提取物可阻止龋病向深层牙本质进展，但对釉质龋及牙本质浅层龋的防治作用有限；8g/L组可显著降低大鼠口内S.mutans水平，显著降低龋齿各级Keyes评分，防龋效能良好，对照CLSM结果可得出一致结论。此浓度相对于体外实验的有效浓度偏高，可能因体内环境为复杂的多菌种生物膜环境，对抗菌剂表现出更强的抗药性。

生物安全性方面，表3可见，初始、第一周时间点各组间体重差异均无统计学意义（P＞0.05），第二周至处死前Control组体重均显著高于其余组别，其余组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。实验第一周进行适应性喂养、S.mutans的定植及检测等实验内容，第二周开始进行药物干预，即2～4周进行为期3周的实验药物干预，正是药物干预阶段，Control组与其余各组体重产生了差异。实验过程中也确发现，药物干预期间各实验组大鼠大便较溏稀，饲料相较于空白对照组吃完的较慢等情况，可能是由于实验中所用的苦参提取物、CHX及长期高糖饮食可能会增加肠胃负担，导致胃肠道功能紊乱，进而导致体重较Control组增加较慢。表4见，6组间脏器系数比较中，肝脏系数差异有统计学意义（P＜0.05），且经LSD-t法两两比较，Control组显著低于其余组别。心脏、肺脏、肾脏、脾脏指数各组间差异均无统计学差异（P＜0.05）。可能是实验中所用的苦参提取物、CHX及长期高糖饮食增加了肝脏的代谢负担，使肝脏代偿性的增大，导致肝脏系数略有增加。张明发[15]等人研究发现，大剂量使用苦参碱可能引起中毒症状，机体中毒时可引起肝脏、肾脏、肺脏和神经麻痹等症状，认为苦参碱可提高中枢神经的兴奋性递质谷氨酸水平，降低抑制性递质γ-氨基丁酸水平，并抑制胆碱酯酶活性从而造成胆碱能神经兴奋，这是苦参碱造成神经麻痹的原因。杨良月[16]对绵羊的毒理学试验表明，大剂量使用苦参碱可造成肺脏、肝脏、脑、肾脏和心脏损伤。但除去自身较难恢复的肺脏，苦参碱造成的肝脏和肾脏造成的损害均可逐渐恢复。苦参碱在应用中比较安全，但不可过量长期使用以，以免造成危害。

表3 6组间6个时间点体重变化情况

综上，8g/L的苦参提取物可有效防龋并有较好的生物安全性，但过量长期使用可能会引起其它系统危害。后期天然药物动物实验的安全性研究中，将对大鼠肠道粘膜及各脏器进行进一步研究。

本实验大鼠口内仅定植S.mutans，不能完全代表复杂的口腔微生物环境，多菌种生物膜的龋病研究对于进一步探索防龋制剂的作用势在必行，课题组后期将致力于此方面的研究。综上，8g/L苦参提取物可有效阻止龋病的发生和进展，并初步表明具有一定的生物安全性，有望成为防龋制剂进入临床。