四川地区养猪场猪细小病毒病的病原检测及遗传进化分析

徐富权 蒋运刚 黄朝冲

（四川省资阳市雁江区小院镇畜牧兽医站，四川资阳 641316）

猪细小病毒病（Porcine parvovirus disease）是由猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）感染引起的一种生殖障碍疾病，PPV可以感染任何年龄段的母猪，但妊娠母猪的症状最为明显，表现为母猪流产，产下木乃伊胎、病弱胎、畸形胎；感染该病毒后母猪表现再怀孕困难、发情不稳定，仔猪感染后引起皮炎和腹泻[1]。繁殖障碍的严重程度取决于毒株的致病性和母猪所处的妊娠期。一般在母猪妊娠30 d内感染，主要导致胚胎死亡或被母体重吸收；母猪妊娠30～70 d感染，主要表现为流产、产死胎、木乃伊胎；母猪妊娠70 d后感染，一般不引起病害，母猪多能正常产仔，但所产仔猪常常带有抗体并长期带毒[2]。PPV经常与猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）、猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）等的1种或几种形成混合感染[3]，给生猪养殖业带来巨大损失。

猪细小病毒为DNA病毒，在分类上为细小病毒科细小病毒属。猪细小病毒的外观具有多形性，一般呈对称的20面体结构，六角形或圆球形[4]。病毒粒子直径约为20 nm，粒子表面没有囊膜，相对分子量为1.4×106[5]。猪细小病毒有2个ORF[6]，其主要编码3个结构蛋白，主要参与病毒基因组的复制、转录等[7]。猪细小病毒在原代和传代细胞中均可以很好地增殖，并可使正常细胞产生病变[8]。猪细小病毒只有1种血清型[9]，不具有很强的变异能力。猪细小病毒对外界环境极不敏感，对热不敏感，给予猪细小病毒70℃处理2 h，猪细小病毒仍然可以进行感染[10]。对一般的消毒剂、紫外线、酸性环境抵抗力很强。

目前为止，全球共发现7种基因型的PPV，PPV1是最早于法国发现的经典基因型，从污染的细胞中分离获得[11]，PPV1是被公认的最常见的基因型，也是造成损失最严重的基因型，目前已在美国、韩国、巴西等国家广泛分布，在我国的湖南、吉林、安徽、广西、山东、福建等地广泛流行。PPV2～PPV6通过宏基因组测序等检测技术陆续被发现[12]。新型细小病毒PPV7是Palinski于2016年利用宏基因组测序在美国健康成年猪的直肠拭子中首次发现的，经鉴定认为是一种新的基因型[13]。本文通过PCR技术对四川地区猪的流产胎儿、死胎等样品进行检测、鉴定，对猪细小病毒病在四川地区的流行进行分析。

1 材料与方法

1.1 样品采集与保存

采集2020—2021年四川地区具有流产情况的猪场样品，样品类型为流产胎儿或胎儿组织、木乃伊胎、畸形胎或畸形胎组织、流产胎衣等，用干净的收集管收集，做好标记，记录样品来源及时间，运输时用冰袋维持低温环境，带回实验室-20℃保存备用。

1.2 主要试剂

本试验主要试剂DL 2 000 Marker、GreenView核酸染料、2×Taq PCR Master Mix购自天根生化科技（北京）有限公司；琼脂糖购自碧云天生物技术有限公司。

1.3 引物名称与序列

参考中华人民共和国出入境检验检疫行业标准《猪细小病毒病检疫技术规范》 （SN/T 1919—2016）中猪细小病毒1型特异性上下游引物序列，由上海生工生物工程技术公司合成引物。

1.4 样品组织处理及DNA提取

准备组织剪、镊子、研钵，利用酒精棉球将器具及周围环境进行灼烧灭菌，待其冷却至室温后，用镊子小心夹出待测组织，用组织剪剪取组织中心未被污染的区域置于研钵中，于-70℃冰箱冻存5 min，5 min后取出快速研磨，研磨后继续冻存3 min，取出后继续研磨，至无明显组织团块，加入1 mL生理盐水研磨均匀，转移至无菌离心管中，8 000 rpm离心2 min，取上清液进行DNA提取[14]。提取的DNA置于-20℃备用。

表1 PCR检测引物

1.5 PCR检测

PCR反应体系为 20 μL，2×PCR Master mix10 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O补足至20μL。PCR反应条件：95℃预变性3 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃1 min，共35个循环；72℃延伸10 min。反应结束后取5 μL扩增产物于1%含核酸染料的琼脂糖凝胶中。电泳后，用凝胶成像分析系统观察拍照，记录检测结果。

1.6 数据处理

根据GenBank收录的不同PPV1毒株的VP2基因序列，使用DNAstar生物学软件Megalign方法进行序列同源性分析，并通过MEGA6邻接法构建系统进化树进行遗传进化分析。

表2 PPV参考序列

2 结果与分析

2.1 PCR检测结果

将样品用VP2基因设计的特异性引物进行扩增，扩增产物用1%琼脂糖进行电泳，结果见图1，PCR结果显示20份样品中有7份样品为PPV1阳性，扩增出445 bp的特异性片段，符合预期。

图1 猪细小病毒VP2基因扩增凝胶成像图

2.2 测序及序列分析

将扩增得到的目的条带送至成都有康生物科技有限公司测序后通过NCBI进行Blast比对，比对发现，该病毒序列与GenBank中的韩国毒株KF9（登录号：MH447550.1）VP2基因同源性为96%。

在NCBI上下载PPV1不同株的VP2基因片段序列，利用邻接法构建系统进化树。系统进化分析结果显示，目的序列与吉林长春毒株DJH24（登录号：MK0923 84）、湖南毒株HuN 1（登录号：MH183298）聚为一支（图2），核苷酸序列之间一致性为96.56%。

图2 猪细小病毒VP2基因部分序列的系统树

3 讨论

猪细小病毒对妊娠母猪产生的危害较大，母猪一旦感染，将会影响整胎仔猪的质量。猪细小病毒病的主要传染源是带毒的公猪和母猪，病毒能通过胎盘垂直传播，检测时除了采集死胎、病弱胎、木乃伊胎的组织，还可以采集脐带血液、胎衣、母猪的阴道分泌物、子宫排泄物等。种公猪也是危险的传染源，病毒可以在公猪的精液、精索、附睾、性腺中复制[15]，公猪的精液采集之后，应该先进行细小病毒的筛查，检测结果为阴性后方可给母猪授精。初产母猪比经产母猪更容易感染，因此，在初产母猪授精、妊娠阶段更应该做好细小病毒的防护隔离，做好疫苗注射计划。有条件的养猪场还应该进行猪细小病毒抗体水平的检测。

从生物安全角度来讲，猪细小病毒的净化比疫苗注射更有效、更重要。但因猪细小病毒抵抗力较强，因此，要想使一个无感染的猪场保持下去，必需采取严格的卫生措施。尽量坚持自繁自养，如必须引进种猪，应从无疫情猪场引进[16]，且引进前需进行猪细小病毒的筛查，引进后进行必要的隔离。妥善处理感染母猪产下的死胎、病弱胎、木乃伊胎及胎衣，对污染的尸体、污物、场地进行严格的消毒，做好无害化处理工作[17]。

疫苗预防是公认的预防猪细小病毒病、提高母猪抵抗力和繁殖率的有效方法[18]。养猪场做好生物安全的同时，也应该做好疫苗免疫计划，妊娠母猪应严格按照疫苗免疫计划进行疫苗注射。猪细小病毒疫苗有活疫苗和灭活疫苗[19]。活疫苗产生的抗体滴度高，维持时间长；灭活疫苗维持时间较短，一般只有半年，可在配种前几周进行免疫[20]。免疫后应测定抗体效价，抗体效价高于1∶80时，即可抵抗猪细小病毒感染[21]。无论是初产母猪，还是经产母猪，每次配种前都应进行免疫注射。谨慎选择疫苗，如果疫苗使用不当会造成人为传入病情，最好使用灭活疫苗。延迟分娩的母猪应该使用前列腺烯醇及时引产，防止胎儿在子宫中腐败滞留，腐蚀子宫膜，引起子宫内膜炎，导致母猪下次配种不易受孕[22]。

从本试验的检测结果来看，近段时间，四川地区的养猪场感染猪细小病毒的情况较为严重，在抽样调查的20份病样中，有7份病样是猪细小病毒阳性，在抽样调查的病样中猪细小病毒感染率为35%。此病发病率呈现升高趋势的原因可能与未曾免疫或免疫程序不科学，引种不慎有关。为此，四川省各个猪场应加强猪细小病毒病的引种检疫及免疫工作，实施科学的免疫程序。

4 小结

综上所述，四川地区猪细小病毒阳性毒株与湖南地区的HuN 1毒株和吉林长春的DJH24毒株有高度的同源性，证明此毒株在中国西南、中部、东北地区广泛传播，且并未进行较大程度的变异。