基于网络药理学和分子对接技术探究清震汤治疗偏头痛的作用机制

徐小港，徐义峰，王 钰，董 辛，章德林*，郑 琴,3*

1江西中医药大学；2江西中医药大学 科技学院；3江西中医药大学 现代中药制剂教育部重点实验室，南昌 330004

偏头痛(migraine)是临床常见的神经系统疾病，主要表现为单侧或双侧的反复搏动性头痛，发作时常伴有面色苍白、恶心呕吐等自主神经症状,持续时间一般是4～72 h[1]，给家庭和社会带来了沉重的负担。据流行病学显示，偏头痛全球患病率为11.6%，是人类致残的主要慢性疾病之一[2]。目前，偏头痛的西医治疗主要采用急性止痛和预防复发等方法，降低头痛发作的频率与程度，从而改善患者生活质量[3],虽有一定疗效，但易出现药物不良反应或依赖性，且作用靶点单一，导致依从性较差，疾病难以根除。中医药在治疗上具有多成分、多靶点、多途径等作用特点，安全性高，在改善偏头痛症状、减少复发次数等方面具有独特优势。

清震汤出自《素问病机气宜保命集》，为刘完素而立，又名“升麻汤”，主治雷头风。方用升麻甘辛微寒，具升阳祛风止痛之功；苍术辛温味苦，可祛风燥湿健脾；荷叶苦平，清热祛风，升发清阳，三药配伍，共奏升阳化湿、清利头目之效。该方虽仅以3味药组成，但配伍精良，疗效确切，被广泛运用于临床，Guo等[4]运用清震汤加味治疗偏头痛患者，总有效率达96.4%，Jiang[5]亦采用清震汤加味治疗偏头痛患者，结果显示可明显改善偏头痛患者的临床症状。清震汤治疗偏头痛效果肯定，但仍集中于临床研究，其具体作用机制尚未阐明。

网络药理学是大数据时代背景下系统生物学、多向药理学、计算机软件等相融合的新兴学科，其通过网络可视化、组学等方法展示疾病、药物、基因及靶点之间的生物网络关系，尤其适合揭示中药及复方的多成分、多靶点、多途径协同作用的机理[6]。基于以上理论，本文以清震汤入血活性成分为研究对象，通过生物信息学分析，并将获得的核心活性成分与潜在作用靶点进行分子对接，探究其治疗偏头痛的作用机制及作用靶点的准确性，进而阐释其临床应用的科学内涵，为研发新药及实验研究提供相应的理论依据，本研究思路流程图见图1。

图1 研究流程图Fig.1 Flow chart of research

1 材料与方法

1.1 清震汤药物活性成分及相关靶点的筛选

清震汤由苍术、升麻、荷叶等3味中药组成，本研究通过中药系统药理学平台(TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)依次查询上述3味中药的有效成分，设定口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%与类药性(drug-like，DL)≥0.18的2个ADME属性值为筛选条件，并结合文献报道，获取有效入血成分及其对应的作用靶点。利用UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)对清震汤入血活性成分靶基因的名称进行标准化。

1.2 偏头痛相关靶点的获取及共同靶点的Venny分析

以“migraine”为关键词，在DrugBank(https://www.drugbank.ca)以及GeneCards(https://www.Genecards.org/)数据库分别进行检索，得到偏头痛的相关靶点。利用jvenn(http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.Html)将清震汤的潜在靶点映射到偏头痛的相关靶点，获得清震汤治疗偏头痛的潜在作用靶点。

1.3 清震汤成分-偏头痛靶点PPI网络构建

将“1.2”项所得的潜在作用靶点导入STRING数据库，将生物种类设定为“Homo sapiens”，最小互相作用阈值设为“medium confidence”(>0.4)，得到蛋白互作网络图及保存TSV格式的PPI数据，将PPI数据文件导入Cytoscape 3.7.1进行图像优化，并运用其中Network Analysis分析有效成分的网络拓扑参数。

1.4 富集分析

将“1.2”项所得的潜在作用靶点导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)，Select Identifier设置为“OFFICIAL GENE SYMBOL”，“Select species”设置为“Homo sapiens”，设定P<0.05，实现GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。

1.5 “中药-化合物-靶点-通路”调控网络的构建

将“1.2”项所得的潜在作用靶点及其相应活性化合物，并结合“1.4”项KEGG通路富集分析结果，通过Cytoscape 3.7.1软件构建清震汤“中药-化合物-靶点-通路”网络，并运用其中Network Analysis分析有效成分的网络拓扑参数。

1.6 分子对接验证

为验证筛选出的清震汤治疗偏头痛潜在关键靶点的准确性，将“1.5”项中核心活性成分与“1.3”项中IL6、CXCL8、FOS、TNF、VEGFA、PTGS2、EGF、IL1B等8个度值较高靶点进行分子对接。在TCMSP数据库中下载活性成分的3D分子结构，从PDB数据库(https://www.rcsb.org/)下载靶点蛋白结构，以人源、分辨度及相关报道为参考，最终确定信息见表1，活性成分与靶点蛋白结构均导入Pymol软件进行脱水，并保存为pdb格式，再通过Autodock软件进行预处理及分子对接，运用Pymol、Discovery Studio 2016软件进行输出优化。

表1 分子对接靶点蛋白结构信息Table 1 Molecular docking target protein structure information

2 结果

2.1 清震汤的活性成分及其靶点

TCMSP数据库中得到苍术、升麻、荷叶的活性成分共329个，经OB≥30%与DL≥0.18的筛选及文献检索，共确定清震汤的活性成分40个，苍术9个，升麻17个，荷叶15个，升麻与荷叶共同成分1个(见表2)。同时收集活性成分相关作用靶点，其中苍术63个，升麻68个，荷叶333个，去除重复靶点后，清震汤活性成分可能作用的靶点为190个。

表2 TCMSP数据库中保留的药物活性成分信息表Table 2 Information table of active ingredients of medicines retained in TCMSP database

2.2 清震汤治疗偏头痛的潜在作用靶点

通过DrugBank、Gencards数据库进行偏头痛疾病靶点筛选，去除重复靶点，得到相关靶点857个；运用Venny作图平台获得清震汤活性成分作用靶点映射于偏头痛的相关靶点(潜在作用靶点)87个(见图2)。

图2 清震汤治疗偏头痛潜在作用靶点Fig.2 The potential targets of Qingzhen Decoction in the treatment of migraine

2.3 清震汤治疗偏头痛潜在作用靶点PPI网络构建

将清震汤治疗偏头痛的潜在作用靶点上传至STRING数据库，得到PPI网络及相关信息，为了更直观了解作用机制，将PPI信息文件导入Cytoscape 3.7.1，得到PPI网络图，共含有86个节点，1 074条边，平均节点数12.5(见图3)。再利用内置Network Analysis分析有效成分的网络拓扑参数，发现IL6、CXCL8、FOS、TNF、VEGFA、PTGS2、EGF、IL1B等节点度值较高，提示这些靶基因在PPI网络中较重要，其可能是清震汤发挥治疗作用的关键靶点。

图3 清震汤与偏头痛共同基因蛋白互作网络Fig.3 Common gene protein interaction network between Qingzhen Decoction and migraine

2.4 富集分析

通过DAVID数据库对清震汤治疗偏头痛的潜在作用靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，均保留P<0.05的结果，得到GO条目436条，包括药物应答(response to drug)、细胞对脂多糖的反应(cellular response to lipopolysaccharide)等生物过程(BP)条目336条，细胞外空间(extracellular space)、质膜的组成部分(integral component of plasma membrane)等细胞组成(CC)条目28条,药物结合(drug binding)，酶结合(enzyme binding)等分子功能(MF)条目72条，对较重要条目运用Origin 2018绘制柱状图进行可视化(见图4)。

图4 清震汤GO功能富集分析Fig.4 Analysis of GO function enrichment of Qingzhen Decoction

KEGG通路富集分析显示，偏头痛可能与TNF信号通路(TNF signaling pathway)、神经信号传递通路(neuroactive ligand-receptor interaction)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、NF-κB信号通路(NF-κB signaling pathway)等92条通路有关，取P值排名前20的通路，运用Cytoscape 3.7.1构建“中药-化合物-靶点-通路”，图形节点为活性成分，正方形为靶点，倒三角形为通路；节点的面积及颜色透明度代表度值，面积越大、颜色越深说明该节点越重要(见图5)。

图5 清震汤“中药-化合物-靶点-通路”网络图Fig.5 "Traditional Chinese Medicine-Compound-Target-Pathway" network diagram of Qingzhen Decoction注：CZ表示苍术；SM表示升麻；HY表示荷叶；SM&HY表示升麻和荷叶的共同成分。Note:CZ means atractylodes;SM means cohosh;HY means lotus leaf;SM&HY means the common component of cohosh and lotus leaf.

2.5 分子对接验证

为明确靶点蛋白与所对应的成分之间的结合活性，本研究选取核心活性成分为作为配体(见表3)，以IL6、CXCL8、FOS、TNF、VEGFA、PTGS2、EGF、IL1B等8个度值较高的基因作为受体，进行分子对接验证。一般认为，配体具有的潜在作用活性越强，与受体结合能量越低，对接打分则越高。分子对接所得结果显示docking score均大于5，且形成范德华力、Pi-Alkyl作用、氢键等，提示核心活性成分与靶点均具有较好的结合活性，分子对接结果见图6，部分分子对接图见图7。

表3 清震汤治疗偏头痛核心成分信息表Table 3 Information table of core components of Qingzhen Decoction for migraine

图6 清震汤中核心活性成分与关键靶点的分子对接打分热图Fig.6 The molecular docking scoring heat map of the core active ingredients and key targets in Qingzhen Decoction

图7 清震汤中活性成分与关键靶点的部分分子对接图(上：3D；下：2D)Fig.7 Part of the molecular docking diagram of the active ingredients in Qingzhen Decoction with key targets (top:3D,bottom:2D)注：a.TNF-豆甾醇；b.PTGS2-豆甾醇；c.FOS-豆甾醇。Note:a.TNF-stigmasterol;b.PTGS2-stigmasterol;c.FOS-stigmasterol.

3 讨论与结论

偏头痛是临床最常见的原发性头痛类型，其发生主要与感受阈值紊乱、疼痛调节功能障碍、皮质兴奋性异常及中枢敏化[7]等因素相关，且近年来呈现高频化、慢性化的发展趋势[8]。目前对于本病的病理机制尚不完全清楚，现代医学普遍接受三叉神经血管学说及遗传学说。研究表明，三叉神经通路中的中枢敏化与三叉神经尾核(TNC)区域中小胶质细胞所释放的炎性介质密切相关，且神经源性炎症被认为是偏头痛发生的基本病理特征[9,10]。中医学认为本病的发生与外感风寒湿邪、气郁、痰浊及血瘀阻滞脑络致不通则痛，或髓海不足、气血亏虚等脑络失养致不荣则痛有关，属于“头痛”“脑风”等范畴。本研究通过网络药理学和分子对接技术，构建“中药-化合物-靶点-通路”网络，以此初步阐释清震汤治疗偏头痛的潜在作用机制。

网络药理学结果显示，槲皮素、山奈酚、豆甾醇等40个成分为治疗偏头痛的潜在活性成分。结合PPI网络及“中药-化合物-靶点-通路”网络发现IL6、CXCL8、TNF、PTGS2等为关键靶点。IL6作为炎性因子，在众多炎症免疫反应中起着重要作用[11]。研究表明，偏头痛患者血清中IL6的水平升高可能与炎症有关[12]。CXCL8在多种神经系统疾病中具有促炎作用，可介导白细胞向炎症部位的迁移[13]。Sarchielli等[14]研究发现偏头痛发作期间CXCL8水平升高，亦有实验结果也证实了该趋化因子参与偏头痛发作期间的白细胞募集[15]。TNF在偏头痛发病中的重要性已得到许多学者的认同，TNF-α是神经血管炎性疾病的潜在疼痛介质，可导致中枢神经系统致敏波谷减少抑制电流，增加兴奋性和诱导COX-2的产生，从而促进炎症性痛觉过敏的发展[16,17]。Franceschin等[18]还发现偏头痛诱导后，在动物模型中TNF-α的mRNA表达增加。PTGS2基因是前列腺素的生物合成的核心酶，有研究表明前列腺素是偏头痛的致痛因子之一[19]。

KEGG 通路富集分析发现清震汤调治偏头痛主要涉及TNF信号通路、神经信号传递通路、HIF-1信号通路、NF-κB信号通路等。实验表明[20]，TNF信号通路能够促进CGRP转录机制从而作用于神经元受体，产生脑膜血管的无菌性神经源性炎症，最终导致偏头痛的发生。NF-κB信号通路涉及NO等多种炎性因子的合成与释放。同时，神经信号传递通路是质膜上与细胞内、外信号通路相关的受体配体的集合，与神经功能密切相关[21]，该通路涉及神经突触上递质的合成、释放及其与受体的作用，使疼痛信号传递至中枢神经[22]。另据文献报道，HIF-1信号通路在体内肿瘤进展和血管生成中起着核心作用，可能与肿瘤所引起的偏头痛有联系[23]。进一步分析发现，上述信号通路通过参与炎症、肿瘤、中枢神经等一系列环节改善偏头痛症状。分子对接结果表明槲皮素、山奈酚、豆甾醇等活性成分与靶蛋白IL6、CXCL8、TNF、PTGS2具有良好的对接活性，提示清震汤活性成分与靶蛋白稳定结合，以此发挥治疗偏头痛的作用。

本文以清震汤为研究对象，通过网络药理学方法初步揭示了清震汤可以通过多个活性成分及作用靶点、调节多条生物通路共同作用于偏头痛，其中可影响药物应答、细胞对脂多糖的反应等生物过程。TNF信号通路、神经信号传递通路、HIF-1信号通路等可能是其治疗偏头痛的主要途径，体现了清震汤可通过多成分、多靶点、多途径治疗偏头痛，可为后续产品的研发提供参考。