高效液相色谱测定二十五味松生等丸中乌头碱的含量

付艺萱，张旭超，王子明，刘鹏，王晓玲

(西南民族大学药学院，四川 成都 610041)

二十五味松生等丸是一种藏药复方制剂，是由松生等、天冬、决明子、鹿角、宽筋藤、小檗皮、琥珀、榜那、糖茶藨等25味药材组成.具有祛风、除湿、干黄水的作用.用于治疗关节炎、类风湿性关节炎、痛风、痹病引起的四肢关节肿大疼痛、变形、黄水积聚等疾病.榜那为二十五味松生等丸中的一味药材，其异名为热度那保(《度母本草》)、满庆、孜巴、热毒、巴保、赞毒等[1].基源植物为铁棒锤、伏毛铁棒锤、伏毛直序乌头或工布乌头[2]，主要有效成分为生物碱，包括乌头碱、次乌头碱、新乌头碱以及雪上一枝蒿乙素、戊素和己素[3].榜那的生品有大毒，藏药制剂中大多以炮制品投料.炮制过程中将有毒的乌头碱、次乌头碱和新乌头碱等双酯型生物碱转化为低毒性的单酯型生物碱或氨醇型生物碱，以降低毒性[4].

据文献报道，乌头碱的限量测定方法有滴定法、分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法、气-质联用法及液-质联用法等[5-13].为了控制产品质量，保证藏药的安全使用，选用了薄层色谱法和HPLC法两种方法分别进行了乌头碱的限量检测预实验.在薄层色谱法预实验中发现二十五味松生等丸的处方药味多，干扰成分多，分子间作用力复杂，使得薄层色谱分离情况不理想，斑点重叠、扩散严重.与斑点集中的对照品色谱相比较，难以用肉眼判断样品中所含乌头碱的量值大小；而且薄层色谱法的分离度和灵敏度比HPLC法低.鉴于此，本文研究建立了高效液相法测定二十五味松生等丸中乌头碱限量的检测方法，以期对二十五味松生等丸的质量标准建立提供参考.

1 实验材料

1.1 仪器

美国Waters 2695型高效液相色谱仪；Waters 2996型PDA检测器；Empower 2.0色谱工作站；Aglient ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；溶剂过滤器(津腾).

1.2 试药

水为超纯水；甲醇、三乙胺为色谱纯；乌头碱、次乌头碱、新乌头碱标准品购于成都普思生物公司(批号依次为：PS000905、PS010171、PS000976)；其余试剂均为分析纯(成都市科隆化学品有限公司).

10个批次的二十五味松生等丸分别收集于4个厂家：西藏甘露藏药有限责任公司(批号：19096A、19097A、16122A 、16122A-1)，西藏林芝宇拓藏药有限责任公司(批号：190501、190501-1)，西藏昌都藏药厂(批号：20190106-1、20190106-2)，西藏神猴药业有限责任公司(批号：20190406-1、20190406-2).

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱及型号规格：Aglient ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流动相∶甲醇-0.5%三乙胺(70∶30)；检测波长235 nm；流速1 mL/min；进样量10 μL；柱温∶室温[14]；色谱柱理论塔板数按乌头碱计算，应不低于5 000.

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液的配制

乌头碱标准品溶液的制备：精确称取乌头碱标准品3.7 mg，放于25 mL容量瓶中，加入0.05 %盐酸甲醇溶液，溶解至刻度，用作标准品储备液.精确量取标准品储备液0.5 mL，放于5 mL容量瓶中，使用0.05 %盐酸甲醇稀释至刻度，用作标准品溶液.

混合标准品溶液的制备：精确称取新乌头碱标准品约1.5 mg、次乌头碱标准品约1.4 mg、乌头碱标准品约1.5 mg，用0.05 %盐酸甲醇配制成浓度分别为0.015 mg/mL、0.014 mg/mL、0.015 mg/mL的混合标准品溶液.

2.2.2 供试品溶液的配制

取供试品粉末5.0 g，精密称定，置锥形瓶中，依次加入50 mL乙醚和4 mL氨试液[15]，振摇，超声处理30min，过滤，滤渣采用上述方法重复提取一遍，过滤，使用旋转蒸发仪将两次滤液合并蒸干，得到残渣，取适量0.05 %盐酸甲醇溶解，转移至5 mL容量瓶中，加入0.05 %盐酸甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液.

2.2.3 阴性对照溶液的配制

将二十五味松生等丸处方中除榜那外的二十四味药材，按照处方的比例配成阴性供试品，精密称取阴性供试品5.0 g，照“2.2.2”项下的制备方法，制备成阴性供试品溶液.

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验

照“2.1”项下色谱条件，精密吸取“2.2”项下制备的乌头碱、次乌头碱和新乌头碱混合对照品溶液，与乌头碱标准品溶液、二十五味松生等丸供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL，分别注入高效液相色谱仪，乌头碱标准品溶液色谱图与供试品溶液出峰保留时间相一致，而阴性对照溶液在此保留时间没有出峰，对实验测定没有干扰.三种双酯型生物碱色谱峰之间分离度良好，均达到基线分离.表明该色谱条件的专属性很强[15].色谱图见图1、图2、图3、图4.

图2 乌头碱HPLC图

图3 供试品(甘露19096A)溶液HPLC图

图4 榜那阴性样品溶液HPLC图

2.3.2 线性关系考察

精确吸取0.014 8 mg/mL乌头碱标准品溶液0.2、0.4、0.6、1.0、1.5 mL，分别置于10 mL量瓶中，按“2.2.1”项下方法稀释至刻度，摇匀，即得系列浓度乌头碱对照品溶液.精密吸取10 μL各浓度乌头碱对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，积分峰面积.以乌头碱对照品的峰面积y为纵坐标，相对应的乌头碱浓度x为横坐标，回归方程：y=933 440x-2 340.4，r=0.999 3，乌头碱浓度在0.059 2 μg/mL～3.330 μg/mL范围内与峰面积线性关系较好[16-18].

2.3.3 精密度试验

精确吸取0.014 8 mg/mL乌头碱标准品溶液10μL，按上述色谱条件连续平行进样分析六次，记录各色谱峰峰面积.结果显示乌头碱标准品溶液的色谱峰峰面积的RSD=0.41%(n= 6)，说明仪器精密度良好.

2.3.4 供试品溶液稳定性试验

精密吸取批号为19096A的供试品溶液，在0、2、4、6、8、10 h按上述色谱条件进样分析，记录色谱峰峰面积.结果显示供试品溶液中乌头碱的峰面积RSD=0.38%，表明标准品溶液在10 h内是稳定的.

2.3.5 重复性试验

精密称定同一批供试品粉末5.0 g，共取6份.供试溶液按“2.2.2”项下制备方法制备.精确吸取10 μL，进样分析[18].结果表明，二十五味松生等丸中乌头碱含量的RSD=1.1%(n=6)，说明本试验测定方法的重复性良好.

2.3.6 加标回收率试验

取已知含量的批号为20190406-1的供试品粉末6份，每份3.0 g，精密称取，置于锥形瓶中，分别加“2.2.1”项下的标准品溶液2.5 mL，加入氨试液4 mL和乙醚50 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液.精密吸取6份供试品溶液、乌头碱标准品溶液各10 μL，分别采用上述色谱条件进样分析.结果显示乌头碱加样回收率在100%～101%范围内，它们的RSD=1.16%.结果见表1.

表1 乌头碱回收率试验结果(n=6)

2.3.7 样品中乌头碱含量测定

分别精密称取10个批次供试品和自制粉末各两份，每份5.0 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液、乌头碱标准品溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件分别进样分析，记录色谱图[19-21].计算各个批次二十五味松生等丸样品中乌头碱的含量.结果见表2.

3 小结

采用高效液相色谱法测定二十五味松生等丸中乌头碱的含量，乌头碱的浓度在0.059 μg/mL～3.330 μg/mL范围内具有良好的线性关系，平均回收率为100.78%，RSD为1.16%.本法操作简便、灵敏度高、结果准确可靠，适用于二十五味松生等丸的质量控制.