基于多元数据融合分析的彝药两头毛治疗胆汁淤积型肝损伤药效及机制研究

王 优，宋 琴，穆卡然·艾买江，李佳川

(西南民族大学药学院，四川 成都 610041)

胆汁淤积型肝损伤(cholestatic liver injury)是临床常见的肝脏类疾病.现代医学认为，由于多种因素引起机体肝细胞或毛细胆管排泄功能异常[1]，胆汁不能正常排泄反而进入体循环，导致胆汁分泌受阻，从而介导胆汁淤积型肝损伤[2-3].临床主要表现为黄疸、肝肿大、皮肤瘙痒、脂溶性维生素缺乏等症状[4-5].若不及时治疗，随着病程的发展，患者出现高胆红素血症、肝衰竭等症的几率较高，严重者甚至死亡[6].因此，早期有效防治并预后具有重要临床意义.近年来，中医药及少数民族医药在肝胆类疾病方面显示出较好的临床优势，疗效确切.

两头毛，彝医称为“瓦布友”，为紫葳科角蒿属两头毛IncarvilleaargtuaRoyel的全草[7]，具有清热解毒、祛风除湿、舒筋活血、抗炎止痛等功效[8]，彝医常用于肝炎、泄泻、痈肿、骨折血肿、风湿劳伤等病治疗[9].现代研究表明，两头毛中富含萜类、甾体、生物碱、黄酮等多种化学成分[10-12]，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗衰老、镇静、防治胆结石等[13]药理作用.特别近年来较多报道及彝医临床反馈，该药在防治病毒性肝炎、酒精性肝病、结石症等疾病方面具有较好的疗效优势[14].因此，本研究结合彝医临床用药经验，运用网络药理学和分子对接技术，初步预测两头毛治疗胆汁淤积型肝损伤的作用机制，并建立胆汁淤积型肝损伤小鼠模型进行药效验证，系统深入探讨彝药两头毛对胆汁淤积型肝损伤的改善作用，以期为药物资源的开发及临床用药提供科学参考.

1 材料

1.1 实验药材

两头毛采自四川省凉山州，经西南民族大学李佳川副教授鉴定为紫葳科角蒿属两头毛IncarvilleaargtuaRoyel的干燥全草.

两头毛提取物的制备：适量称取两头毛干燥药材，加入75% 的乙醇，于圆底烧瓶冷凝回流3次，每次2 h，过滤，合并滤液，减压蒸发浓缩得浸膏.将浸膏用蒸馏水配制到所需浓度，于4 ℃冰箱保存备用.

1.2 动物

ICR小鼠，SPF级，18～22 g，全雄，成都达硕实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK(川)2021-030.本实验获得西南民族大学实验动物伦理委员会批准，符合中国伦理委员会指导原则.

1.3 试剂与仪器

熊去氧胆酸胶囊(UDCA)，LosanPharma GmbH，H20181059；α-萘异硫氰酸酯(ANIT))，Sigma-Aldrich，170518-5G；谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)，均购于南京建成生物工程研究所；酶标仪(CYT5M，美国伯腾仪器有限公司).

2 方法

2.1 两头毛活性成分及其作用靶点的筛选

通过知网、万方、维普、pubmed、web of science等数据库对两头毛的化学成分进行检索，整理出两头毛的化学成分.借助TCMSP数据库(https:// tcmspw.com/tcmsp.php)对两头毛的化学成分进行检索和相关靶点收集，并运用Uniprot数据库对靶点名称进行规范化.利用PubChem数据库(https: //pubchem. ncbi.nlm.nih.gov/)查询活性成分的SIMLE号[15]，导入SwissTarget Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)预测活性成分的相关作用靶点.

2.2 疾病靶点的预测

以“胆汁淤积型肝损伤(Cholestatic liver injury)”为关键词从GeneCards(http://www.genecards.org/)数据库检索胆汁淤积型肝病相关的疾病靶点，并利用Venny 2.1.0平台(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)获取疾病靶点与两头毛活性成分对应靶点的交集[16].

2.3 蛋白互作网络的构建

将共有靶点上传至STRING数据库(https://string-db.org/)获取蛋白互作关系，蛋白设置为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值设为中等(0.7)，结果导入Cytoscape 3.7.1软件构建蛋白-蛋白相互作用(protein proteininteraction,PPI)网络，并对PPI网络进行拓扑学分析[15].

2.4 “成分-疾病-靶点”网络的构建

利用Cytoscape 3.7.1软件对两头毛活性成分及其作用靶点构建“成分-靶点”网路，使用Merge工具将“成分-靶点”网络与蛋白互作网络合并，并对其进行拓分析，以度值(Degree)中位数的2倍、节点介度(Betweenness Centrality)与节点紧密度(Closeness Centrality)的中位数为参数进行筛选，得到“成分-疾病-靶点”核心网络.

2.5 富集分析

将共有靶点上传至DAVID 6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/)，物种及背景选择“Homo sapiens”、设置P<0.05，进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析[17].使用Cytoscape 3.7.1软件中的Merge功能，将收集到的KEGG通路富集结果和“成分-疾病-靶点”核心网络导入，构建“成分-靶点-通路”核心网络，实现富集分析结果的可视化.

2.6 分子对接

通过对“成分-疾病-靶点”核心网络进行分析，结合文献资料和相关实验研究，将筛选出的两头毛有效活性成分与疾病潜在靶点进行分子对接.从PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中检索两头毛有效活性成分的2D结构，并在PyRx 1.5.6软件中对各化合物进行能量最小化，作为小分子配体备用[18].在Uniprot数据库中检索疾病潜在靶点的蛋白序列，利用SWISS-MODEL建模平台(https://swissmodel.expasy.org/)建立靶点蛋白3D结构，并在AutDock Tools 1.5.6软件对蛋白进行去水、加氢、添加原子电荷等预处理，存为受体备用.运用PyRx 1.5.6软件将两头毛活性成分与疾病靶点进行对接打分，并借助Discovery Studio Visualizer软件将对接结果可视化[19].

2.7 动物实验验证

参照文献[20]，取ICR小鼠，全雄，随机将动物分为5组，每组10只，即空白组、模型组、UDCA(0.1 g·kg-1)组和两头毛醇提物高、低(2、1 g·kg-1)组.UDCA组和两头毛醇提物高、低组按小鼠体重灌胃给药(0.1 mL·10g-1)，空白组和模型组给予等体积生理盐水，连续给药7 d.给药第5 d，以80 mg·kg-1ANIT经口灌胃制备胆汁淤积型肝损伤小鼠模型，空白组给予等体积橄榄油，灌胃前后12 h自由饮水，禁食.小鼠末次给药后1 h，小鼠眼眶取血，分离血清，按相关试剂盒说明书分别检测ALT、AST、ALP、TBIL和DBIL的含量/活性.

3 结果

3.1 两头毛活性成分及靶点的筛选结果

通过文献检索得到相关文章76篇，将目前文献中已有研究的两头毛化学成分整理、汇总并去重，得到两头毛化学成分共136个.利用TCMSP数据库和PubChem数据库对各化学成分进行检索，检索得到101个化学成分，并对其相应靶点进行预测，删去重复靶点，共得到940个靶点.

3.2 疾病相关靶点的预测

通过GeneCards数据库检索得到1 879个与胆汁淤积型肝损伤相关的疾病靶点，并与两头毛活性成分作用靶点取交集(见图 1)，得到318个共有靶点，提示这318个靶点可能是两头毛治疗胆汁淤积型肝损伤的候选靶点.

3.3 PPI网络的构建及分析

将318个共有靶点上传STRING数据库获得蛋白相互作用信息，并导入Cytoscape 3.7.1中构建两头毛与胆汁淤积型肝损伤共有靶点的PPI网络，如图2所示.该网络图中有298个节点和2 966条边，节点越大，表明度值越高.利用Cytoscape3.7.1中的MCODE插件对PPI网络进行聚类分析，一共聚为五类，见图3，依次是红色聚类网络、橙色聚类网络、绿色聚类网络、蓝色聚类网络、黄色聚类网络，得分分别为15.179、14.812、4、3、2.997.其中，红色聚类网络得分最高，提示该聚类中的节点可能是两头毛防治胆汁淤积型肝损伤的关键靶点.

图3 PPI网络聚类图

3.4 “成分-疾病-靶点”网络的分析结果

将两头毛活性成分和胆汁淤积型肝损伤的对应关系导入Cytoscape 3.7.1软件，绘制“成分-靶点”网络(图4).在“成分-靶点”网络中包括了1 036个节点和5 914条边，其中，包括95个绿色节点和941个紫色节点，分别代表有效活性成分及靶点.通过比较“成分-靶点”网络中各成分的度值，筛选度值排名靠前的活性成分分别是胡椒碱、海罂粟碱、diincarvilone A、熊果酸、观音莲明碱、齐墩果酸、(9Z,12Z)-Octadeca -9,12- dienoic acid、5-羟基-4′,6,7-三甲氧基黄酮、argutalactone、argutosine A及N-methylcorydaldine等.

图4 两头毛“成分-靶点”网络图

利用Cytoscape 3.7.1软件中的Merge功能，将“成分-靶点”网络与PPI蛋白互作网络合并，构建“成分-疾病-靶点”网络，以节点连接度(degree)的2倍中位数14、节点介度(betweenness) 和节点紧密度(closeness)的中位数0.001 8、0.321 428 6为卡值[21]，选取同时满足3 个卡值的节点，构建“成分-疾病-靶点”核心网络，见图5.该网络图包括367个节点(84个红色节点代表化合物和283个蓝色节点代表靶点)，5 883条边.节点degree值大于14的潜在靶点有RAC-α丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase,AKT1)、信号转导与转录激活因子3 (signal transdu- cer and activator of transcription 3,STAT3)、丝裂原活化蛋白激酶3 (mitogen-activated protein kinase, MAPK3)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase, MAPK1)、磷脂酰肌醇3-激酶调节亚基(phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1,PIK3R1)、胱天蛋白酶3(Caspase-3,CASP3)、白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)等，推测上述靶点可能是两头毛治疗胆汁淤积型肝损伤的潜在作用靶点.

图5 “成分-疾病-靶点”核心网络图

3.5 富集分析结果

KEGG富集分析共获得134条信号通路(P<0.05)，主要涉及炎症反应、免疫应答、激素调节、细胞增殖、氧化应激等通路.图6为KEGG富集结果分析结果中较为显著的20条通路气泡图，基因数越多点越大，P值越小点的颜色就越深[22].将这20条通路与核心网络相关联，可得到如图7所示的“成分-靶点-通路”网络，该网络中包含367个节点和5 883条边，84个红色节点表示活性成分，283个蓝色方形节点表示潜在作用靶点，20个绿色节点表示信号通路.结合胆汁淤积型肝损伤的疾病特点，与该病密切联系的通路主要包括NOD样受体信号通路(NOD-like receptor signaling pathway)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、胆汁分泌(Bile secretion)等信号通路，提示两头毛可能通过上述通路来调控机体胆汁分泌、缓解炎症反应，从而达到其治疗胆汁淤积型肝损伤的目的.

图6 KEGG通路富集结果

图7 两头毛“成分-靶点-通路”图

3.6 分子对接结果

一般认为，结合能的大小，代表化合物配体与靶蛋白受体结合的稳定性，当结合能< 0，表明化合物与靶点蛋白能够自发地结合.“成分-疾病-靶点”核心网络中排名靠前的活性成分与关键靶点的分子对接结果如表1所示，活性成分海罂粟碱、齐墩果酸、Diincarvilone A、观音莲明碱、胡椒碱、熊果酸、5-羟基-4,6,7-三甲氧基黄酮与胆汁淤积性肝损伤相关靶点STAT3、MAPK3、TNF、IL1B、MAPK1、IL6、CASP3、PIK3R1、PIK3CA、AKTI均能自发结合，均具有较强的结合能力.其中，Diincarvilone A、熊果酸与受体蛋白的结合能最高，结合活性较强，其与各受体蛋白的分子对接模式见图8.从价键结合角度来看，Diincarvilone A、熊果酸均能与各受体蛋白稳定结合.Diincarvilone A与IL1B中PHEA249、LY5A10、LYSA193、THRA195等氨基酸残基通过氢键、碳氢键、烷基等作用力结合；Diincarvilone A与AKTI中ASNA204、LYSA8、ARGA206、TYRA263、VALA7等位点通过范德华力、氢键、碳氢键、Π等作用力结合；熊果酸与TNF中PHEA36、PHEA32、CYSA30、ILEA40、LEUA33位点主要通过烷基结合；熊果酸与MAPK3中GLYA262、SERA263、PROA264、LEUA261等残基通过范德华力、氢键、烷基作用力结合.综上，两头毛主要活性成分与疾病相关靶点结合性能较好，与网络药理学预测结果相符.

表1 活性成分与关键靶点的分子对接结果

图8 分子对接结果

3.7 药效验证结果

如表2所示，与空白组比较，模型组血清 ALT、AST、ALP、TBIL和DBIL 含量/活性明显升高(均P<0.01)，表明动物模型造模成功.与模型组比较，两头毛血清中ALT 、AST和ALP酶活性均明显或部分降低，胆汁淤积相关指标TBIL和DBIL含量也明显降低(P<0.01～0.05)，显示出两头毛提取物对 ANIT 致小鼠胆汁淤积型肝损伤具有一定的改善作用.

表2 两头毛对小鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL和DBIL含量的影响

4 讨论

胆汁淤积型肝损伤的发病病因和损伤机制较为复杂，中医认为，该病归属于“黄疸”、“淤黄”等中医范畴，主要是由于湿热痰淤、郁阻血分、肝胆失泄致胆汁外溢而泛全身所引起[4].近年来，彝医结合用药经验，将两头毛组方配伍大量用于各类肝病的治疗，均获得较好临床疗效.特别是该药物具有清热解毒、健脾利湿之功效，与中医治疗胆汁淤积症肝损伤“利湿退黄”的治则相一致.现代药理学研究也表明，两头毛不仅具有抗炎、抗氧化作用，还具有增加胆汁酸的合成与转运[23]、抑制肝细胞凋亡[24]、保护肝脏细胞[25]、降低体内胆固醇含量及甘油三酯水平[26]，从而起到保肝利胆的作用.

在“成分-疾病-靶点”核心网络筛选出的两头毛有效活性成分中，胡椒碱[27]、熊果酸[28]、齐墩果酸[29]、海罂粟碱、Diincarvilone A、观音莲明碱、(9Z,12Z)-Octadeca -9,12- dienoic acid、5-羟基-4′,6,7-三甲氧基黄酮等化合物的对应靶点较多且度值较高，可能是两头毛防治胆汁淤积型肝损伤的潜在药效物质，以上成分均表现出较强的退黄、降酶、修复肝细胞损伤，抑制炎性反应，促进胆汁酸排泄的作用，这些药理作用为两头毛治疗胆汁淤积型肝损伤提供了理论依据.预测得到的AKT1、STAT3、MAPK3、IL6、TNF、JUN、VEGFA、IL1B、MAPK1等关键靶点，涉及炎性反应、氧化应激、免疫应答、细胞的增殖分化等生物途径，与胆汁淤积型肝损伤密切相关.

对关键靶点进行KEGG通路富集分析，结果发现两头毛可能是通过调控PI3K-Akt、JAK-STAT、NF-kB、TNF、NOD样受体、Toll样受体及胆汁分泌等信号通路发挥胆汁淤积型肝损伤的治疗作用.PI3K-Akt信号通路对细胞的增殖、分化、凋亡等多种功能具有调节作用，抑制其下游靶蛋白Caspase9、NF-KB、GSK-3等表达，保护肝细胞免受胆汁酸所诱导的细胞凋亡[30].杨仁俊等[31]发现PI3K/AKT信号通路失活，肝细胞凋亡受到抑制，增强细胞损伤，加重了胆汁淤积性肝损伤的发生发展，表明其参与胆汁淤积型肝损伤病程的调控.NF-κB蛋白质复合物参与细胞生成与分化，调节氧化应激，在免疫反应中起关键作用.研究发现，通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，可降低炎症因子的释放、肝内胆汁酸含量，减轻肝细胞受损程度，达到修复肝细胞的作用[32].JAK是非受体酪氨酸激酶家族，JAK -STAT途径是多种炎性因子的主要信号传导机制，参与细胞增殖、分化、凋亡等过程.TNF-α是肝脏炎症损伤中的重要影响因素之一[22]，可直接损伤肝细胞，并促进与IL-1、IL-6的分泌，协同促进肝脏炎症性损伤[33].马洪第[34]发现，Toll样受体的缺失，相关炎症因子水平的表达增加，且加重细胞炎性浸润及肝内胆管的破坏.已报道的实验研究和本文预测结果均表明，PI3K-Akt、JAK-STAT、NF-kB、TNF、NOD样受体、Toll样受体及胆汁分泌等途径可能是两头毛抑制肝脏炎症反应，缓解细胞损伤，抑制氧化应激反应，促进胆红素的代谢，进而改善胆汁淤积，从而发挥胆汁淤积型肝损伤的治疗作用.分子对接结果显示， STAT3、MAPK3、IL1B、MAPK1、IL6、PIK3R1、AKTI等靶点与两头毛中海罂粟碱、Diincarvilone A、观音莲明碱、胡椒碱、熊果酸、齐墩果酸、5-羟基-4,6,7-三甲氧基黄酮等有效成分能自发、稳定地结合，提示以上有效成分可能是治疗胆汁淤积型肝损伤的潜在药效物质.

同时，为了验证上述分析结果，建立胆汁淤积型肝损伤小鼠模型进行药效验证.结果显示，两头毛能够明显或部分抑制模型小鼠血清中ALT、AST、ALP、TBIL和DBIL含量/活性.ALT、AST分布于细胞体内，是炎症反应、细胞坏死的关键指标，当肝细胞受损后进入体循环，导致血清中 ALT 和 AST 异常升高[35]；实验结果发现两头毛能显著降低模型小鼠血清 ALT、AST水平，表明两头毛能够抑制炎症反应，改善肝细胞受损.ALP 主要分布在肝脏中，在胆汁排泄过程中发挥重要作用，胆汁淤积致使胆汁排泄受阻，ALP水解作用被抑制，其酶活性升高；两头毛能显著降低模型小鼠血清ALP水平，表明两头毛能够减少胆汁淤积，促进胆汁排泄.TBIL和DBIL在评估肝汁淤积中起主要作用，二者的升高，说明胆道内胆红素的排泄受到了阻碍；两头毛能显著降低模型小鼠血清TBIL、DBIL的水平，表明两头毛具有一定的促进胆红素，改善胆汁酸代谢，减少胆汁淤积和黄疸的药效作用，共凑保肝利胆的功效.

综上所述，两头毛有效成分可能通过作用于多个关键靶点来改善胆汁淤积，调控PI3K-Akt、JAK-STAT、NF-kB、TNF、NOD样受体、Toll样受体及胆汁分泌等途径，从而促进胆汁分泌，抑制炎症反应，以治疗胆汁淤积型肝损伤，与动物实验结果基本相一致.研究揭示了两头毛通过多靶点、多途径、多通路治疗胆汁淤积型肝损伤的复杂机制，为两头毛的进一步临床应用及资源开发提供了科学参考；同时，结果也证明了利用网络药理学和分子对接技术预测药物治疗疾病的药效及作用机制具有较好可行性和科学性.