响应面法优化羊源解淀粉芽孢杆菌冻干保护剂配方

张 玲，张楠驰,2，魏 勇，许 锋，张 林，王 利，俄木曲者

(1. 西南民族大学动物科学国家民委重点实验室, 四川 成都 610041； 2. 阿坝职业学院，四川 茂县 623200 3.动物遗传育种四川重点实验室，四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066)

微生物制剂便于长期储藏和使用，在动物饲养研究上取得了理想试验结果[1].解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)属于革兰氏阴性菌，可产生蛋白类、脂肽类等多种抗菌物质[2]，具有溶菌、诱导抗性等作用，已作为生防菌应用于水产养殖[3]、食品[4]，医疗[5]等领域.目前解淀粉芽孢杆菌多用于防治农作物病虫害[6]，可提高动物免疫机能，有望替代动物饲料添加剂中的抗生素[7-8].解淀粉芽孢杆菌SC06[9]可通过激活Nrf 2通路提高仔猪抗氧化能力，进而改善肠道功能，抑制肝脏损伤，可提高黄羽肉鸡机体免疫功能和抗氧化能力[10].研究表明，解淀粉芽孢杆菌可改善断奶黑山羊的瘤胃发育和肠道菌群，降低瘤胃和盲肠的病原菌丰度[11].本研究拟通过响应面分析法制备并优化羊源解淀粉芽孢杆菌fsznc-06的冻干菌剂，以提高解淀粉芽孢杆菌冻干存活率，旨在为解淀粉芽孢杆菌在动物饲养的应用提供一定数据支持和科学依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)为本课题组前期从金堂黑山羊粪便中分离，经生理生化和分子生物学鉴定并保藏于西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用重点实验室，编号fsznc-06[12].

1.1.2 主要试剂

甘露醇(AR)、甘氨酸(BR)、D-山梨醇(BR)、葡萄糖(一水、AR)、蔗糖(AR)、可溶性淀粉(AR)、丙三醇(AR)购自成都市科隆化学品有限公司，L-脯氨酸(BR)、麦芽糊精(BR)购自北京索莱宝科技有限公司，海藻糖(BR)购自上海源叶生物科技有限公司.

1.1.3 主要仪器

真空冷冻干燥机购自泰事达(西班牙)公司、电子天平购自沈阳龙腾电子有限公司，高速冷冻离心机购自艾本德中国有限公司，哈东联恒温振荡培养箱、生物安全柜购自Baker公司、电热恒温培养箱购自上海齐欣科学仪器有限公司、细菌浊度计购自上海昕瑞仪器仪表有限公司、超低温冰箱购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司、菌落计数器购自英国BibbySterilin公司.

1.2 方法

1.2.1 生长曲线的绘制和离心条件的筛选

将单菌落接种到LB液体培养基中，置于37 ℃、180 r/min的恒温培养箱培养，每隔6 h采用细菌浊度仪计算菌液浓度.无菌各取5 mL培养24 h的菌液，分别以4 000、5 000、6 000、7 000 r/min转速离心10 min、15 min，弃上清，PBS缓冲液补至5 mL振荡混匀后涂布计数，计算菌株在各种离心条件下的存活率.

1.2.2 单一冻干保护剂的筛选

将山梨醇、甘露醇、脯氨酸、甘氨酸、丙三醇配置成浓度梯度为1、3、5、7、9、11 g/100 mL的保护剂，海藻糖、麦芽糊精、蔗糖、葡萄糖、淀粉配置成浓度梯度为1、4、7、10、13、16 g/100 mL的保护剂，121 ℃灭菌15 min.分别加入2.5 mL菌液离心，收集菌体沉淀，-80 ℃预冷4 h以上，0.05 mBar、-80 ℃冻干24 h以上.冻干后加2.5 mL无菌水稀释涂布进行活菌计数，以灭菌蒸馏水为保护剂作为空白对照，测定冻干前后活菌数，计算菌体存活率，筛选三种保护效果最好的保护剂.

菌株存活率(%)=冻干后活菌数(cfu)/冻干前活菌数(cfu)×100

1.2.3 复合冻干保护剂优化研究及冻干菌剂稳定性检测

根据1.3.2单一冻干保护剂的筛选结果，采用Box-Behnken方法设计试验(三因素三水平)并制备复合冻干保护剂，冻干流程、条件和检测方法同1.3.2.将制备好的冻干菌剂分别于室温、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃保存，并分别在30、60、90、120、150和180 d复苏并检测冻干菌剂的菌株存活率，每组5个平行样品.

冻干菌剂存储n d存活率(%)=存储n d的活菌数(cfu)/冻干前活菌数(cfu)×100

1.2.4 数据统计和分析

采用Design Expert 11.1进行响应面的设计、数据的分析和回归模型的建立.试验数据均以mean±SD表示.用GraphPad Prism 5.0软件制图.

2 结果

2.1 生长曲线和离心条件

解淀粉芽孢杆菌菌株0～12 h生长较缓慢，12～36 h为对数生长期，在42 h左右fsznc-06菌液浓度达到最大值，约1.92×109CFU/mL.根据各离心条件下菌株存活率高低，选择6 000 r/min离心10 min的离心条件对菌株fsznc-06进行处理，菌株存活率相对最高，约为71.30%，详见图1.

图1 解淀粉芽孢杆菌fsznc-06生长曲线和离心存活率 A：生长曲线；B：离心存活率Fig.1 The growth curve and centrifugal effect on bacteria survival rate of Bacillus amyloliquefaciens fsznc-06

2.2 单一保护剂筛选结果

结果表明葡萄糖、丙三醇和蔗糖作为保护剂对解淀粉芽孢杆菌fsznc-06的保护效果相对最佳，最高存活率分别约为70.85%、66.42%和67.53%，此时保护剂最佳浓度分别为4 g/100、4 g/100 mL和3 g/100 mL，详见表1.

表1 各种保护剂对解淀粉芽孢杆菌fsznc-06冻干存活率的影响(%)

Concentration No. 1～6 of sorbitol, mannitol, proline, glycine, glycerine: 1, 3, 5, 7, 9 and 11 g/100 mL; Concentration No. 1～6 of trehalose, maltodextrin, sucrose, glucose, starch: 1, 4, 7, 10, 13 and 16 g/100 mL.

2.3 保护剂优化及冻干菌剂稳定性检测

采用Design Expert 11.1对存活率试验结果(表2)进行回归分析，得到优化后的二次回归方程为R=92.82+7.22A-6.99B+3.59C-1.7AB-10.94AC+1.36BC-7.6A2-13.04B2-31.18C2，方差分析结果(表3)显示，响应面模型F值为21.8，P值小于0.000 1，回归方程R水平极显著，说明试验设计可靠.方程Adjusted R2为0.878 1，表示87.81%的响应值可以通过所建模型来解释，说明方程R拟合效果很好.从三因子交互作用响应面(图2)结果来看，各因子间响应面均呈向上凸出，且中部附近存在最高点，即有极值的存在.根据优化后的二次回归方程，当A=0.051、B=-0.358、C=0.032时所得响应值最高，预测存活率为94.08%，此时冻干保护剂配方为丙三醇(3.102 g/100 mL)、蔗糖(2.926 g/100 mL)和葡萄糖(7.096 g/100 mL).按照该配方制备菌株fsznc-06冻干菌剂，冻干后马上复苏检测该配方平均存活率约为96.47%，与预测存活率接近，说明建立的模型合理有效.冻干菌剂稳定性检测结果显示，菌株fsznc-06冻干菌剂前60 d在室温条件存储效果最佳，但在90 d～180 d时的最佳存储温度为4 ℃，在存储180 d时，4 ℃下的存活率约为66.30%，而-80 ℃条件下的存活率最低，详见图3.

表2 菌株fsznc-06存活率Box-Behnken Design试验设计与结果

表3 菌株fsznc-06二次响应面回归模型的方差分析结果

图2 三因子交互作用对菌株fsznc-06冻干存活率影响的响应面图

图3 解淀粉芽孢杆菌fsznc-06冻干菌剂在不同贮藏温度下的存活率

3 讨论

冷冻干燥技术是制备微生物制剂的常用方法之一，而保护剂可有效减轻菌株在冷冻干燥过程中的损伤，提高菌体存活率并延长存储时间.丙三醇是一种应用广泛的多元醇类冻干保护剂，保护胞内各分子结构免受缺水损伤，维持细胞活力[13].蔗糖是小分子膜外保护剂，可抑制细胞膜发生相变而保持液晶态[14].葡萄糖可为细胞代谢提供能量，也可降低膜相变的温度，抑制生物膜在冻干过程中的融合[15].杨玲等[16]报道了两歧双歧杆菌最优冻干保护剂配方为：脱脂乳添加量12%、海藻糖12%、丙三醇1.2%、谷氨酸钠0.6%、L-半胱氨酸盐酸盐0.15%.王大欣等[17]分别报道了蔗糖和葡萄糖对巨大芽孢杆菌和短小芽孢杆菌发挥了较好的冻干保护效果，因此保护剂的选择对提高冻干菌剂的保护效果尤为重要.本试验通过筛选得到丙三醇、蔗糖、葡萄糖对解淀粉芽孢杆菌的存活率保护效果最好.

目前有多种方法优化保护剂配方，如陈胜杰等[19]采用真空冷冻干燥法通过单因素和正交试验筛选出凝结芽孢杆菌最优冻干保护剂配方为低聚木糖 8%，VC钠盐3%，可溶性淀粉14%，脱脂乳粉 8%，冻干存活率为83.7%.王宪斌等[20]采用水平正交法筛选，但该方法筛选出的保护剂浓度只能人为设计，对配方的优化效果存在一定的局限性.响应面分析法利用多元线性回归方程可得出更为精确的试验结果，徐颖等[21]采用响应面法优化富硒鼠李糖乳杆菌冻干保护剂配方为海藻糖7%、谷氨酸钠5%、脱脂乳粉10%，冻干存活率达89.86%.另外，由于芽孢杆菌可产生芽孢的特性，采用优化的保护剂配方制备的冻干菌剂存活率明显高于葡萄球菌、乳杆菌等冻干菌剂[22-23].国内对解淀粉芽孢杆菌冻干保护剂的研究与应用较少，庞超等[24]采用响应面分析法优化解淀粉芽孢杆菌冷冻干燥的保护剂配方为脱脂乳(10%)、海藻糖(11.06%)、乳糖(7.03%)、谷氨酸钠(3.00%)，冻干存活率为85.59%，其与清酒乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌作为复合菌发酵腊豆.张楠驰[11,25]等采用解淀粉芽孢杆菌冻干菌剂可促进小鼠生长，提高免疫以及提高黑山羊的生长性能、免疫指标和肌肉发育相关基因的表达等，表明该冻干菌剂在动物饲养的应用上有益.

本试验通过响应面法优化得到解淀粉芽孢杆菌最佳复合冻干保护剂配方为：丙三醇(3.102 g/100 mL)、蔗糖(2.926 g/100 mL)和葡萄糖(7.096 g/100 mL)，其冻干存活率达到96.47%.结果表明响应面法对优化解淀粉芽孢杆菌复合冻干保护剂是可行的，冻干保护的效果较好，有效延长了该菌的储存时间，具有较好的市场应用价值.