固定化菌剂的制备及其对含油土壤的修复研究

张琪雯 周飞 陈啸

摘      要：选取前期实验中从长庆油田措施廢液集中处理后残渣中筛选的3株高效石油烃降解菌D1、D2、D5作为研究对象，采用吸附法制备固定化菌剂，制备过程的最佳条件为：秸秆和草炭固定化菌剂的最佳固定化时间均为36 h，木炭的最佳固定化时间为30 h;秸秆固定化菌剂和草炭固定化菌剂的最优载体加入量为3.0 g/100 mL菌悬液;木炭固定化菌剂的最优载体加入量为2.0 g/100 mL菌悬液。秸秆固定化的最佳pH为7.0，草炭和木炭固定化的最佳pH为7.5;三种载体固定化菌剂的最佳固定化温度均为35 ℃。在未灭菌的含油土壤40 d的室内原位模拟修复过程中，各固定化菌剂对石油烃的降解率大小依次为：草炭固定化菌剂74.12%>木炭固定化菌剂70.25%>秸秆固定化菌剂60.74%>游离混合菌35.48%>不加菌对照11.98%。在灭菌的含油土壤的修复过程中，几种处理方式对石油烃的降解率大小依次为：木炭固定化菌剂70.75%>草炭固定化菌剂69.90%>秸秆固定化菌剂68.28%>游离混合菌44.30%>不加菌对照2.21%。

关  键  词：固定化菌剂;微生物修复;复合菌群

中图分类号：X53            文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2019）02-0251-05

Abstract： Three high-efficiency petroleum hydrocarbon degrading bacteria， D1， D2， and D5， isolated from the residue after concentrated treatment of Changqing oilfield wastewater in the previous experiment were selected as research objects. Immobilized microbial agents were prepared by adsorption method， and the best preparation conditions were determined as follows： the optimal immobilization time was 36 h for straw and peat as a carrier and 30 h for charcoal; The optimal carrier dosage for straw， peat and charcoal to immobilize microbial agent were 3.0， 3.0 and 2.0 g per 100 mL bacterial suspension; The optimal pH for immobilization of straw， peat and charcoal were 7.0， 7.5 and 7.5; The optimal immobilization temperature for all three kinds of carriers was 35 ℃.During indoor simulation repairing of unsterilized oily soil for 40 d by using immobilized bacteria agents， the degradation rates of the petroleum hydrocarbons were as follows： peat immobilized bacteria agent 74.12% > charcoal immobilized bacteria agent 70.25% > straw immobilized bacteria agent 60.74% > free mixed bacteria 35.48% > control treatment （non-added bacteria） 11.98%. In the period of remediation of sterilized oily soil， the degradation rates of petroleum hydrocarbons were as follows： charcoal-immobilized microbial agent 70.75%> peat- immobilized microbial biomass agent 69.90%> straw immobilized microbial agent 68.28%> free-mixed bacteria 44.30%> control treatment （non-added bacteria） 2.21%.

Key words： Immobilized microbial agents; Microbial repair; Complex flora

含油土壤是指由于在油田采油及运输途中，由于不正常的操作或其他事故等造成的落地原油与泥土或其他杂质形成的含油固体废物[1]。针对含油土壤的治理，国内外提出了较多的处理方法以及工艺流程，但因含油土壤成分和性质较为复杂，每种治理方法都存在一定的局限性。微生物降解技术因其成本较低、操作简便、无二次污染、效果好等特点而被广泛采用。石油是一种由各种烃类和非烃类物质构成的复杂化合物。微生物对于烃类化合物的降解有各自的局限性，通常单个菌株只能降解一定范围内的石油烃，并且降解代谢过程往往是分步进行的，复合菌群是由具有相互协同促进的多种菌株组成的群体，利用不同菌株的协同作用，扩大底物的范围，可以较好的提高石油烃的降解效率，则可形成一个完整高效的降解系统[2]。由于石油烃污染修复的降解菌大部分都是游离菌，降解过程中因为污染物的成分复杂，产生的一些次生代谢产物和中间产物具有较大的毒性，而且很难被微生物所降解。因此，固定化技术被逐渐引入土壤的修复中来[3]。

吸附法是一种比较简单的固定化方法，因其具有固定操作简单、反应条件较温和、固定化成本低等多重優点而被广泛应用于含油土壤和废水的治理 [4]。本文制备了三种固定化复合菌剂并对其性能进行了研究。

1  实验部分

1.1  试验材料

1.1.1  菌种来源

实验室前期从含油土壤中筛选出的的3株高效石油烃降解菌株：D1（Bacillus sp.）、D2（Streptococcus sp.）和D5（Alcaligenes sp.）。

1.1.2  培养基的制备

基础培养基为牛肉膏蛋白胨培养基和无机盐培养基（NH4NO3 2.0 g，K2HPO4 1.0 g，KH2PO4 0.5 g，无水CaCl2 0.02 g，MgSO4.7H2O 0.5 g，NaCl 5.0 g）。在上述无机盐培养基中加入0.5%原油即可得原油液体培养基，再添加一定比例琼脂即可得原油固体培养基。

1.1.3  试剂与仪器

石油醚、Na2HPO4、NH4Cl和无水硫酸钠皆为分析纯。紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.1.4  载体来源

秸秆：陕西省渭南市某县收集;木炭：购置于广州科骆尔生物能源科技有限公司;草炭：购置于辽宁清原泥炭土加工厂。以上载体经通风阴干后用粉碎机粉碎，过80目筛，备用。

1.2  实验方法

1.2.1  固定化复合菌剂的制备

将3株单菌的菌悬液分别按照正交优化条件下的最佳的接种比例混合即可制得混合菌悬液;分别称取2.0 g的三种载体，加入到装有100 mL牛肉膏蛋白胨培养基的250 mL锥形瓶中，121 ℃高压灭菌20 min。接入6 mL混合菌悬液，150 r/min，30 ℃恒温摇床震荡培养36 h后，用双层纱布进行过滤，并用灭菌的生理盐水进行洗涤2～3次，即可得固定化复合菌剂[5]。

1.2.2  原油降解率的测定

原油降解率的测定采用超声萃取-紫外分光光度法进行测定。在无菌条件下，接入固定化的复合菌剂至装有100 mL灭菌的原油液体培养基中，30 ℃、150 r/min恒温摇床震荡培养7 d后，加入25 mL石油醚，超声波萃取其中的石油，此步骤重复3次，将上层液合并转至分液漏斗，收集上层萃取液，过滤后进行定容，以石油醚作为空白参比，测定OD值，计算含油率，与初始的含油量作对比，计算原油降解率[6]。

1.2.3  固定化菌剂与载体、载体-菌液混合物的降解对比实验

首先准备10组已灭菌的100 mL原油液体培养基，在其中分别加入6 mL混合菌液、2.0 g载体（3种）、2.0 g载体（3种）与6 mL混合菌液的混合物、2.0 g载体固定化菌剂（3种），150 r/min，30 ℃恒温摇床震荡培养5 d，测定原油降解率。

1.2.4  最佳固定化时间的确定

称取2.0 g三种载体，接入6 mL混合菌液之后，150 r/min，30 ℃恒温摇床震荡培养18、24、30、36、42、48 h后，制得固定化菌剂，将其加入100 mL原油液体培养集中，30 ℃，150 r/min水浴摇床震荡培养5 d，测定原油的降解率，以判断最佳固定化时间。

1.2.5  最佳固定化载体的量的确定

分别称取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g载体，接入6 mL混合菌液，150 r/min，30 ℃恒温培养36 h，得固定化菌剂。加入100 mL原油液体培养基，150 r/min，30 ℃恒温培养5 d，测定原油的降解率。

1.2.6  最佳固定化pH的确定

2.0 g载体，接入6 mL混合菌液之后， pH调为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，150 r/min，30 ℃恒温培养18、24、30、36、42、48 h，制得固定化菌剂。将其加入100 mL原油液体培养基中，30 ℃，150 r/min水浴摇床震荡培养5 d，测定原油的降解率。

1.2.7  最佳固定化温度的确定

称取2.0 g三种载体，接入6 mL混合菌液之后，分别置于不同温度恒温摇床中培养36 h后，制得固定化菌剂，将其加入100 mL原油液体培养集中，30 ℃，150 r/min水浴摇床震荡培养5 d，测定原油的降解率。

1.2.8  固定化复合菌剂对含油土壤的修复

将配置好的5%的原油浓度的供试土壤200 g放入100 mL烧杯中。在含油土壤中加入10%的各种固定化复合菌剂，每个处理设3个平行对比实验。含油土壤分为灭菌组和未灭菌组不同处理。30 ℃培养40 d，每2 d补加无菌水，使其含水率保持在35%左右，每天翻动土壤。分别在0、5、10、15、20、25、30、35、40 d，四分法取样测定原油降解率。

1.2.9  土壤中石油烃含量的测定

将降解后的含油土壤风干后磨碎，称取2.0 g试样置于50 mL比色管中，加入25 mL石油醚超声15 min，过滤收集滤液至50 mL烧杯中，再加入20 mL石油醚进行超声波提取，合并提取液至100 mL容量瓶中，紫外测定含油浓度。降解率计算如下：

石油烃降解率（%）=%

式中：W0—降解前的石油烃浓度，mol/mL;

W1—降解后的石油烃浓度，mol/mL。

2  结果与讨论

2.1  固定化菌剂与载体、载体-菌液混合物的降解效果的对比

由图1可以看出，降解率最高的是草炭固定化菌剂，达到了92.02%，再依次是木炭固定化菌劑和秸秆固定化菌剂，降解率分别为89.28%和85.25%，均高于单独投加载体和载体-菌液混和物的降解率。

2.2  最佳固定化时间的确定

不同固定化时间制得的固定化菌剂，原油降解效果如图2所示。

由图2可以看出，三种载体固定化菌剂的原油降解率均呈先升高再下降的趋势。秸秆和草炭固定化菌剂的最佳固定化时间均为36 h，原油降解率最高达到了87.46%和87.07%;木炭的最佳固定化时间为30 h，原油降解率为83.89%。

2.3  最佳固定化载体的量的确定

不同载体的量制得的固定化菌剂，降解效果如图3所示。

从图3可以看出，秸秆固定化菌剂和草炭固定化菌剂达到最高降解率时，秸秆和草炭的投加量为3.0 g;木炭固定化菌剂达到最高降解率时，木炭的最佳投加量为2.0 g。

2.4  最佳固定化pH的确定

不同pH条件制得的固定化菌剂，降解效果如图4所示。

从图4可以看出在pH为7.0的时候，秸秆固定化菌剂的原油降解率最大，达到了87.77%，在pH为7.5时，木炭固定化菌剂和草炭固定化菌剂的原油降解率达到最大，分别为81.39%和89.08%。偏酸或者偏碱的环境一方面会影响载体的吸附效果，也会影响到微生物自身的生长。中性偏碱性环境有利于微生物的生长代谢，吸附作用也较强。

2.5  最佳固定化温度的确定

不同温度下制得固定化菌剂原油降解效果如图5所示。

由图5可以看出，以秸秆、木炭和草炭为载体的固定化菌剂的固定化温度为35 ℃时，原油降解率均达到最佳，分别为89.08%、81.79%和91.12%。温度过低或过高时，微生物的生长代谢活性程度不高，从而使得降解率下降。

2.6  修复过程微生物对含油土壤降解率的影响

以不加入混合菌剂的土壤组作为空白对照，含油土壤高压灭菌和不灭菌两种不同的处理方式对其进行为期40 d室内模拟修复，其降解变化趋势的结果如图6和图7所示。

由图6可以看出，未灭菌的含油土壤由于土著微生物的作用，不加菌的对照组的原油降解率随着时间的增长而缓慢增加，在降解40 d后的最大降解率只达到了11.98%。游离混合菌的降解率也随着时间的增加而增长，但是降解率相对于灭菌组较低，可能是由于土著微生物对土壤中营养物质的竞争作用，使得游离混合菌的生长受到限制，其最高降解率达到了35.48%。[7] 三种载体的固定化菌剂中，草炭的降解率最高，达到了74.12%，可能是因为草炭载体是由沼泽植物的残体堆积形成的，质地较为松软易于分散，有机质含量较高，菌体可吸附的比表面积较大，大大地促进了菌体与原油的接触面积，也提供较多的营养物质;木炭载体的表面也具有较大的孔状结构可供微生物附着，它的吸附能力也较强，提供了较大的微生物与原油的接触面积，对含油土壤的降解率达到了70.25%;秸秆载体的吸附能力较前两种载体的吸附性弱，表面较为光滑，微生物的附着能力较差，40 d时的降解率达到最高，为60.74%。[8]未灭菌组的石油烃的降解率大小依次为：草炭固定化菌剂>木炭固定化菌剂>秸秆固定化菌剂>游离混合菌>不加菌对照。

由图7可以看出，载体固定化菌剂对石油烃的去除效率高于不加菌的对照组和游离的混合菌。

不接菌的对照组的降解率很低并且在降解过程中石油烃含量几乎无变化，降解率的些许升高可能是由于石油烃的自然挥发。游离混合菌对石油烃的降解率随着时间的增加而增加，0～10 d的石油烃降解率增加的速率较小、10～25 d的石油烃的降解率增加较快，原因是在修复的前期，碳源丰富，微生物大量繁殖，对石油烃的消耗较快，25～40 d时，营养物质消耗，微生物的代谢强度下降，且石油烃中易于降解的烃类被大量利用，原油的降解速率相对趋于稳定，最后其最大降解率达到了44.30% [9]。在对混合菌进行固定化后，降解率提高较大，木炭和草炭的固定化菌剂降解效果要优于秸秆固定化菌剂。木炭和草炭这两种载体具有较大的比表面积，对原油有着较强的吸附能力，能够加快原油的去除效率。秸秆的表面较为光滑致密，传质性能较差，使得微生物吸收营养物质的能力降低。[10]在降解进行到40 d的时候，三种载体固定化菌剂对原油的去除效率均达到最大，其中木炭固定化菌剂达到了70.75%，草炭和秸秆固定化菌剂也分别达到了69.90%和68.28%。灭菌组的石油烃的降解率大小依次为：木炭固定化菌剂>草炭固定化菌剂>秸秆固定化菌剂>游离混合菌>不加菌对照。

3  结 论

吸附法固定化菌剂的制备过程的最佳条件为：秸秆和草炭固定化菌剂的最佳固定化时间均为36 h，木炭的最佳固定化时间为30 h;秸秆固定化菌剂和草炭固定化菌剂的最优载体加入量为3.0 g/100 mL菌悬液;木炭固定化菌剂的最优载体加入量为2.0 g/100 mL菌悬液;秸秆固定化的最佳pH为7.0，木炭和草炭固定的最佳pH为7.5;三种载体固定化菌剂的最佳固定化温度均为35 ℃。

对未灭菌含油土壤进行40 d的室内原位模拟修复过程中，各固定化菌剂对石油烃的降解率大小依次为：草炭固定化菌剂74.12%>木炭固定化菌剂70.25%>秸秆固定化菌剂60.74%>游离混合菌35.48%>不加菌对照11.98%。在灭菌的含油土壤的修复过程中，几种处理方式对石油烃的降解率大小依次为：木炭固定化菌剂70.75%>草炭固定化菌剂69.90%>秸秆固定化菌剂68.28%>游离混合菌44.30%>不加菌对照2.21%。

參考文献：

[1]李启锋. 采油现场含油污泥处理工艺及装置研究[D]. 西安： 西安石油大学， 2017.

[2]刘天璐.含油污泥对水体的污染及净化试验研究[D].杭州：浙江大学， 2017.

[3]彭香玉. 石油降解混合菌的构建及其固定化修复污染土壤的研究[D]. 西安：陕西科技大学， 2015.

[4]王博. 土壤石油降解菌的筛选与微生物生态修复研究[D]. 南京：南京农业大学， 2012.

[5] 李政，赵朝成，张云波，等.耐热石油降解混合菌群的降解性能研究[J].化学与生物工程.2012，28（12）：37-42.

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