浙江省广西越桔组织培养及遗传多样性分析

王挺进 袁 璐 刘 柯 刘玲娟 刘胜龙 陈利萍,* 文香英

(1浙江大学农业与生物技术学院园艺系，浙江 杭州 310058; 2浙江凤阳山国家级自然保护区，浙江 龙泉 323700；3中国科学院华南植物园，广东 广州 510650)

广西越桔(Vacciniumsinicum)是杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(Vaccinium)的小灌木，生长于海拔1 200～1 700 m的山林、山谷石等地，主要分布于我国湖南、广东及广西地区[1]。叶立新等[2]于2001年首次在浙江省凤阳山发现广西越桔，标志着其分布区域向东北扩展。因个体数极少、自然更新能力差，凤阳山上的广西越桔面临局部地区灭绝的危险。2012年，广西越桔被列入《浙江省重点保护野生植物名录(第一批)》[3]。因此，广西越桔的保护和繁育对维护种质资源多样性有着十分重要的意义[4-5]。目前关于广西越桔的研究主要集中在分布地域、生境、植株形态、花果期等方面[6-7]，而对其进行保护的研究尚鲜见。

凤阳山上的广西越桔虽然每年都开花结果，但未观察到自然更新后代。研究表明，对于自然界中难以自然更新的种群，可以通过早期胚培养减少胚育的发生，使其继续生长发育成完整植株，并以此开展人工保护和繁育研究[8-11]。因此，通过培养未成熟种子获得有性后代及其离体快繁是保护广西越桔种质资源遗传多样性、扩大种群数量的有效途径。

本研究以采集于浙江省凤阳山的广西越桔未成熟果实为材料，通过未成熟种子培养获得试管实生苗。以试管实生苗茎段为外植体，培养于木本植物培养基(woody plant medium, WPM)[12]，附加不同浓度6-苄氨基腺嘌呤(6-benzylaminopurine, 6-BA)或玉米素(zeatin, ZT)和α-萘乙酸(naphthalene acetic acid, NAA)，建立离体快繁体系。在此基础上，通过相关序列扩增多态性分子标记(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)[13]分析原生株与后代群体间的遗传多样性，以期将遗传多样性丰富的试管苗群体经炼苗后回归至凤阳山-百山祖国家级自然保护区，并为相近处境珍稀植物的保育和利用提供理论与实践依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以采集于浙江省凤阳山的广西越桔原生株的未成熟果实为材料，未成熟果实表皮坚硬，呈浅绿色。

1.2 试验方法

1.2.1 材料消毒与灭菌 将未成熟果实用洁净流水冲洗2 h后，置于超净工作台内，用75%酒精浸泡30 s， 无菌水冲洗3次。再用0.1% HgCl2水溶液浸泡处理10 min，无菌水冲洗3次。最后在无菌滤纸上将果实的表面水分吸干。

1.2.2 未成熟种子培养 纵向切开果实后取下未成熟种子及部分子房组织，接种至发育培养基(表1)，先于温度25℃的黑暗条件下培养24 h后，再于光照强度20 μmol·m-2·s-1、 光照时间12 h·d-1条件下培养24 d后统计发育率。

待未成熟种子种皮变为暗褐色、种子饱满即发育完全，接种至萌发培养基(表1)，于温度25℃、光照强度20 μmol·m-2·s-1、光照时间12 h·d-1条件下培养60 d后统计萌发率。萌发率=萌发种子数/发育完全种子数×100%；总萌发率=萌发种子数/种子总数×100%。

表1 培养基成分Table 1 Component of medium

1.2.3 增殖培养与生根培养 种子露白后转移至生长培养基(表1)培养。生长至6～7 cm时，取带有一个腋芽的茎段，接种至1～8号增殖培养基(表1)进行增殖培养，以接种至生长培养基为对照。增殖培养60 d后统计增殖系数(增殖系数=总再生芽数/总外植体数×100%)和茎段长度。再生芽长至3～4片叶时接种至生根培养基(表1)。培养条件均为：温度25℃、光照强度50 μmol·m-2·s-1、光照时间12 h·d-1。

1.2.4 种群增强与回归 培养得到完整再生植株，株高达6～7 cm后，用清水洗去培养基，移栽入经高压蒸汽灭菌的基质中(泥炭∶蛭石∶珍珠岩=3∶1∶1)进行炼苗。炼苗条件为：温度22℃/18℃、光照强度50 μmol·m-2·s-1、 光照时间12 h·d-1。炼苗期间每14 d浇施少量水溶肥，30 d后选取壮苗移栽至保护区苗圃，在苗圃中生长6个月后于回归试验地进行种群增强与回归，6个月后观察植株生长情况。期间由保护区工作人员定期清除竞争植被，统计移栽前后成活率、株高、株幅、成熟叶长、成熟叶宽、一级分枝数。

1.2.5 SRAP-PCR体系建立及遗传多样性分析 通过SRAP分子标记对凤阳山野生广西越桔原生株及试管实生苗后代进行遗传多样性分析。提取叶片DNA，采用2×Taq PCR Master Mix进行SRAP-PCR反应。在20 μL体系中，对反应的退火温度、模板DNA含量、引物浓度进行五水平优化，其中退火温度设置为46、48、50、52、54℃，模板DNA含量设置为40、60、80、100、120 ng，引物浓度设置为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μmol·L-1。研究退火温度、模板DNA含量、引物浓度对反应的影响时，固定其他影响因素水平为模板DNA含量120 ng、引物浓度0.5 μmol·L-1、退火温度48℃。经初步筛选采用引物组合Me7+Em8和Me8+Em1(表2)进行反应。反应结束后，在20 μL体系扩增产物中加入4 μL 6×Loading Buffer，94℃变性5 min。冷却后利用6%聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)进行电泳分离和强碱银染检测。记泳道中清晰易辨的条带为“1”，同一迁移率处无清晰条带的为“0”，建立0/1矩阵，并用NTSYS-pc2.1软件计算遗传相似系数(genetic similarity, GS)。

表2 试验所用SRAP引物Table 2 SRAP primers used in this study

2 结果与分析

2.1 未成熟种子培养

为了解决广西越桔无自然更新后代的问题，本试验以其未成熟果实为材料，开展了未成熟种子培养。从原生株上取得4颗未成熟果实，果实直径6.31±0.34 mm，表皮坚硬，呈绿色，蜡质不明显，萼片开放呈浅粉紫色(图1-a)。4颗未成熟果实中共有未成熟种子27粒，呈长卵形或纺锤形，种皮浅黄褐色，较饱满；败育种子共3粒，形状不规则，种皮浅黄色，较干瘪。

27粒未成熟种子在发育培养基上培养25 d后，其中23粒种皮颜色加深，由浅黄褐色(图1-b)转为深棕褐色(图1-c)，种子体积略增大，视为发育完成，发育率为85.19%。将发育完成的种子接种至萌发培养基，培养60 d后共萌发7颗种子，萌发率达30.43%，总萌发率为25.92%。种子萌发后，生长成为试管实生苗(图1-d)。在未成熟种子培养过程中，无污染发生。因此，可以通过未成熟种子培养获得广西越桔有性后代，改变凤阳山广西越桔无有性后代的现状。

2.2 离体快繁体系建立

为了扩大个体数量以迅速建立种群，本试验以未成熟种子培养得到的试管实生苗为外植体，利用不同浓度植物生长调节剂配比的培养基，建立了离体快繁体系。结果显示，相比6-BA，ZT处理能更有效地诱导芽的发生(表3，表4)，6～8号增殖培养基均可诱导出丛生芽(图2-a)，其中6号增殖培养基对芽的诱导率最高，为106.67%(表4)，1～4号增殖培养基与生长培养基均只诱导出单个再生芽。在一定浓度范围内，6-BA和ZT处理后再生枝长度呈现先增加后减少的趋势，ZT处理更有效地促进再生枝的生长，再生枝长度均大于对照组(表3，表4)，其中6号增殖培养基中再生枝长度最长，为4.88 cm(表4)。因此，确定6号增殖培养基为最佳增殖培养基，可达到较高的增殖系数并有效促进再生枝的生长。

注：a：未成熟果实； b：未成熟种子；c：发育完全种子；d：试管实生苗。Note: a: Immature fruit. b: Immature seed. c: Fully developed seed. d: In ritro seedling.图1 广西越桔未成熟种子培养Fig.1 Immature seeds culture of V. sinicum

再生枝长至3～4片叶后接种至生根培养基培养45 d后，成活率及生根率达100%，根系生长旺盛且再生植株生长良好(图2-b)。在离体快繁体系建立过程中，无污染发生。

表3 6-BA对广西越桔茎段增殖系数及长度影响Table 3 Effects of 6-BA on the multiplication coefficient and the length of stem in V. sinicum

2.3 种群增强与回归

种群增强与回归可改善种群结构，调节种群动态，使现存天然种群得到恢复壮大。本试验将生长至6～7 cm的完整再生植株进行炼苗并回归至原发现地。炼苗过程中再生植株生长良好，未发生污染，成活率达100%。经过30 d的炼苗处理，将其中23株壮苗回归至保护区苗圃，6个月后存活23株，成活率为100%。再回归至试验地，6个月后存活22株，成活率为95.65%，生长良好(表5，图3)。结果表明，离体快繁得到的再生植株适应回归试验地生境，有望建立起具

表4 ZT对广西越桔茎段增殖系数及长度影响Table 4 Effects of ZT on the multiplication coefficient and the length of stem in V. sinicum

注：a：丛生芽的诱导；b：生根培养。Note: a: Induction of cluster buds. b: Root induction.图2 广西越桔快繁体系的建立Fig.2 In vitro propagation of V. sinicum

有一定适应能力，且能自然更新的种群。

通过对已回归植株进行形态学观察，发现其中2株(记为Ⅱ类，图4-a)在叶形、叶色、叶质上与其他植株(记为Ⅰ类，图4-b)及原生株存在差异(表6)：Ⅱ类叶形为阔椭圆形近圆形、叶色浅绿、叶质革质化浅；Ⅰ类和原生株叶形为阔椭圆形，叶色浓绿、叶质革质化深，表明未成熟种子培养获得的后代与原生株相比发生表型变异。

2.4 遗传多样性分析

为了探究原生株与未成熟种子培养后代群体的遗传多样性，本试验以原生株与后代群体为材料，以初筛Me7+Em8、Me8+Em1引物组合为前后引物，发现在退火温度48℃、模板DNA浓度80 ng、引物浓度0.4 μmol·L-1条件下获得最多清晰条带(表7)。

以原生株(记为P)及未成熟种子培养后代(记为S1～S7)为模板DNA，利用上述反应条件，以不同引物组合扩增并进行后续分析(图5)。通过统计分析建立

表5 植株回归前后生长情况Table 5 Growth states of seedlings before and after reintroduction

表6 植株叶形差异Table 6 The difference of leaf shape

0/1矩阵，采用NTSYS-pc2.1软件计算得到P和S1～S7群体的遗传相似系数在0.727 1～0.977 8之间，平均相似系数为0.841 0，极差为0.250 7(表8)。结合回归结果，原生株与未成熟种子培养后代群体在遗传结构上确实存在差异且可能引起表型变异。

注：a：2017年10月生长情况；b：2018年4月生长情况。Note: a: Situation of plant growth in Oct. 2017. b: Situation of plant growth in Apr. 2018.图3 植株回归前后生长情况Fig.3 Growth state of seedlings before and after reintroduction

注：a：Ⅱ类植株；b：Ⅰ类植株。Note: a: Type Ⅱ plant. b: Type Ⅰ plant.图4 回归植株群体的两种表型Fig.4 Two phenotypes of plant populations after reintroduction

表7 不同反应条件对广西越桔SRAP-PCR体系的影响Table 7 Effects of different reaction conditions on SRAP-PCR of V. sinicum

3 讨论

浙江省广西越桔种群数量极小，亟需保护其种质资源并扩大种群数量，为此本研究采用组织培养技术进行未成熟种子培养及其离体快繁。研究表明，组织培养克服了传统无性繁殖方法速度慢、繁殖系数低等缺点，便于集约化管理和工厂化生产，可用于越桔属植物及其他众多珍稀濒危植物的快速培育[14-16]，并且可避免不利环境因素影响，尤为适用于珍稀植物种质资源的离体保存[17]。对于野生珍稀植物而言，其遗传多样性越丰富，对环境变化的适应能力就越强[18]，因此必须通过有性繁殖保护其遗传多样性，单纯通过无性繁殖扩大种群数量难以改变珍稀现状。本研究以广西越桔未成熟果实中的未成熟种子为起始材料，保存了不同基因型的有性后代，并通过离体快繁增加了种群数量。

注：红色方框内为显著差异区域。Note: Significantly different areas are in the red box.图5 部分引物组合SRAP扩增结果Fig.5 SRAP amplification results of parts of primer combinations

表8 样本间的遗传相似系数Table 8 Genetic similarity coefficients among samples

野生越桔属植物主要依靠种子繁殖，但自然条件下其种子萌发率低，种群自然更新能力弱。富晶晶等[10]研究发现，幼嫩种子经培养后萌发率可达44.5%，高于成熟种子的32.0%。本研究中，广西越桔的未成熟种子经离体培养后可发育完全直至萌发，萌发率达30.43%，而凤阳山未观察到自然更新后代，因此采用未成熟种子培养进行保护是科学的。此外，王明洁等[19]以400 mg·L-1GA3溶液浸泡笃斯越桔种子，使萌发率达91.3%，而本研究中，广西越桔种子的萌发率仅为25.92%，一方面可能是物种本身特性引起的种子活力不足，另一方面可能是发育完全的种子进入休眠，因此在后续研究中可通过诱导未成熟胚萌发或适当提高培养基中的GA3浓度等方式进一步提高广西越桔种子的萌发率。通过离体快繁可在短时间内获得大量长势良好的组培苗，这一研究结果与前人观点一致[20]，相比愈伤组织再生途径，本研究主要通过“短枝发生型”再生途径获得再生芽，虽然增殖系数较低，但遗传变异少。Cheng等[21]发现ZT对越桔属植物不定芽再生具有良好的促进作用，本研究也发现ZT的促进效果优于6-BA，因此在野生越桔属植物离体保护中，可优先考虑ZT。

利用高共显性的SRAP分子标记进行遗传多样性分析发现，有性后代与原生株群体间的相似系数在0.727 1～0.977 8之间，平均为0.841 0，极差为0.250 7，说明群体遗传结构在部分特定区域存在差异，这种差异可能来自杂合原生株有性繁殖过程中的自交分离、基因重组或自然变异等。采用SRAP分子标记可实现后代群体的早期鉴定[22]，据此本研究通过筛选不同基因型的后代个体回归至原分布的自然或半自然生境中，以期建立具有一定规模且适应环境变化，能够自然维持与更新的新种群，这对种群以及生态系统保护具有重要意义。因种群内个体由原生株自交(或近交)产生，导致遗传多样性水平较低。但研究表明，在遗传多样性水平低的情况下，增加表型多样性也有利于种群适应环境[23]，因此观察到的广西越桔后代表型变异也是适应环境变化的潜在基础。通常因生长速度慢、环境适应性差等不足，珍稀濒危植物回归后处于弱势，难以与生长繁殖能力强和争夺光照、养分及空间等能力强的植物如禾本科植物竞争，导致回归试验成功率较低，植株长势不良甚至逐渐死亡[24-25]。而凤阳山杜鹃花科植被资源丰富，如灌木层的优势种即鹿角杜鹃(Rhododendronlatoucheae)、杜鹃(Rhododendronsimsii)等[2]，一定程度上说明了凤阳山生境适宜杜鹃花科植物生长，且土壤中杜鹃花类菌根真菌丰富，其在杜鹃花科植物的营养吸收、逆境生理、生态适应等方面具有重要作用[26]。前人研究表明蓝莓虽缺失根毛，但内生菌根真菌对其具有显著的促生作用，可支持其迅速生长[27]。得益于适宜的生境和杜鹃花类菌根真菌的共生，回归的广西越桔成活率达95.65%。因此，在凤阳山建立广西越桔回归种群是科学可行的。但广西越桔生长缓慢，回归后仍未开花结实，可在后代达到开花年限后采用人工授粉的方式增加坐果率和萌发率[28]，并进一步探究种群能否完成自然更新。此外，广西越桔果径大、观赏性强，随着种群数量的扩大，可有目的性地进行开发利用，如作为栽培越桔育种的亲本，培育更适于南方地区生产的越桔品种。

4 结论

本研究通过未成熟种子培养和离体快繁等试管保育技术获得了广西越桔试管实生苗和再生植株。未成熟种子经发育培养后萌发，获得试管实生苗。以试管实生苗为外植体，在WPM培养基中添加0.2 mg·L-1ZT 和0.5 mg·L-1NAA可达到最高增殖系数并促进再生芽的生长；在添加0.1 mg·L-1IBA后达到最高生根率。经炼苗后将种群回归，植株长势良好、株幅显著增加。SRAP分析表明原生株与后代群体具有一定的遗传多样性。