基于代表性植株二次选择和多元统计分析的芦笋芽期苗期耐盐性鉴定及综合评价

仪泽会 毛丽萍 赵 婧 孙黛珍

(1 山西农业大学农学院，山西 太原 030031；2 山西农业大学园艺学院，山西 太原 030031)

土壤盐渍化是农业生产的主要限制因素之一，严重影响植物的生长发育。据估计，全球约有20%的耕地和33%的可灌溉农田严重遭受盐碱胁迫影响[1]，同时，耕地受气候、地层盐性及不当农事操作等因素影响，盐渍化问题呈日益加重的趋势，对农业可持续发展造成了严重威胁[2]。生物改良措施因效果好、成本低，已成功应用于盐碱地改良，其中，以种植耐盐植物辅以其他农业措施的综合改良法较为常见，不仅可以增加经济效益，而且可对盐渍化土壤进行生态修复[3-5]。芦笋(Asparagusofficinalis)，又名石刁柏，富含芦丁、氨基酸等多种功能成分，具有抗肿瘤[6]、降血糖[7]、增强免疫力[8]等作用。芦笋种植效益高，且抗逆能力突出[9]，在盐碱地开发中具有较大应用潜力。因此，开展耐盐种质鉴定对芦笋耐盐品种选育、耐盐机理研究和盐碱地开发利用具有重要意义。

高效可靠的耐盐性鉴定方法和评价体系是准确评价芦笋耐盐性的基础。目前，耐盐性鉴定主要为田间鉴定法和室内鉴定法。盐碱地、人工盐池等田间全生育期鉴定方法更贴近生产实际，但成本较高且费时费力，同时鉴定结果易受到盐分、水分等外界不可控环境条件影响，不适宜进行大规模资源鉴定[10]。植物芽期和苗期易受盐害，是耐盐性鉴定的关键时期[11]。良好的出苗率和壮苗率是作物优质高产的基础，基质栽培和营养液水培等室内芽期苗期鉴定方法具有成本低、周期短、受外界环境影响小的特点，适于大规模资源鉴定，但因参与胁迫处理的是代表性植株，选择依据是大小、长势一致，常以经验为主。 为了消除不同种质间的固有性状差异，常采用代表性植株的耐盐系数(即盐胁迫处理与对照的性状相对值)来对耐盐性进行描述。因此，代表性植株的选择对鉴定结果起决定作用。芦笋属典型的雌雄异株植物，严格自交难度大，致使育种资源基因型难以纯合，品种纯度不高[12]。前人就芦笋耐盐性开展了少量研究。谢启鑫等[9]对25份芦笋种质进行耐盐性室内鉴定，筛选出耐盐品种6个，将冠军和Apollo划分为较耐盐类型，而将硕丰划分为中度耐盐。胡淑明等[13]以生育指数为指标，筛选出8份耐盐性材料，认为硕丰耐盐性明显强于冠军和Apollo。山西农业大学园艺学院蔬菜栽培课题组前期试验发现，基于传统经验选择的芦笋代表性植株在同一处理下的各单株性状值仍存在较大差异，说明该选择方法仅适用于纯度较高的植物品种(如陆地棉[14])，对芦笋等纯度不高的植物长势判断存在较大偏差，导致性状相对值反映的不完全是耐盐系数，从而影响鉴定结果。然而，目前客观判断长势是否一致的方法尚无相关报道。植物耐盐机理极为复杂，涉及多个途径，采用单一指标难以准确评价，运用隶属函数法、主成分分析法、聚类分析等多元统计分析方法可以克服单一指标和单一方式评价的局限性，目前已成功应用于有色大麦[2]、芦笋[9]、长果黄麻[10]、粒用高粱[11]、陆地棉[14]、甘薯[15]、白花草木樨[16]、薏苡[17]等众多作物。

本研究以49份芦笋品种为材料，采用二次选择法选择代表性植株，即首次选择株高和根长一致的植株为预代表性植株，培养若干天后，再次根据株高和根长进行二次选择确定为代表性植株，然后以310 mmol·L-1NaCl溶液进行芽期苗期胁迫处理，运用多元统计分析方法进行综合评价，以期为芦笋耐盐品种选育、耐盐机理研究及盐碱地开发利用提供种质材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为49份芦笋品种，包括常用育成品种及新选育组合，其中国内25份、国外24份(表1)。试验于2020年6月30日在山西省农业科学院蔬菜研究所生理实验室实施，选取籽粒饱满、大小一致的种子，采用3% NaClO溶液消毒，经40℃温水浸种48 h后，一部分进行正常催芽，另一部分进行芽期盐胁迫处理。待催芽种子大部分露白时，进行播种育苗。育苗基质自配，V椰糠∶V草炭∶V蛭石∶V珍珠岩=2∶1∶1∶1，穴盘规格为32孔。

1.2 试验设计

试验采用Hoagland营养液水培，购自福州飞净生物科技有限公司。为确定耐盐性鉴定的适宜盐浓度，随机选择京绿芦笋3号、翡翠明珠、冠军和UC157共4个品种，设置NaCl浓度梯度为110、210、310和410 mmol·L-1，以0 mmol·L-1NaCl为对照(CK)进行预试验。通过测定芽期、苗期指标发现，310 mmol·L-1NaCl处理下4个品种的耐盐系数差异最明显，确定为适宜盐浓度。

芽期耐盐性鉴定方法：以一次性透明塑料饭盒(底部14.3 cm×9.2 cm，顶部16.8 cm×11.8 cm，高4.3 cm)为容器，向其中倒入500 mL营养液，漂浮装置为一次性透明塑料水杯杯底(高度约1 cm)，杯底打10个直径为3 mm的圆洞，种胚朝下放入浸种处理过的种子，保证种胚可接触到营养液且不会掉入营养液中，标记液面位置，分3 d连续向营养液中添加NaCl至预定浓度。每组50粒种子，随机区组，3次重复，期间添加纯水保持液面高度。以胚芽和胚根长度均超过种子直径的1/3为发芽标准，第4天开始每天统计发芽数，在第10天结束统计。然后，依据株高和根长选择代表性植株，两次选择间隔3 d，再经5 d培养后测定芽高和胚根长。

幼苗期耐盐性鉴定方法：在山西省农业科学院东阳试验基地日光温室进行穴盘育苗，苗后45 d时，选取各品种株高、根长大致一致的植株进行营养液培养，容器为一次性透明水杯(底部半径2.6 cm，顶部半径3.4 cm，高8.1 cm)，放入营养液150 mL，标记液面位置；培养10 d后，再次根据幼苗株高和根长每组选取10株为代表性植株，然后同芽期盐胁迫处理方法处理15 d，随机区组，设3次重复。

1.3 测定项目及方法

发芽率(germination rate，GR)和发芽势(germination potential，GP)通过统计发芽数测定。

发芽率=第10天发芽种子数/供试种子数×100%

发芽势=第7天发芽种子数/供试种子数×100%

芽高(sprout height，SH)、胚根长(radicle length，RDL)、幼苗株高(plant height，PH)和幼苗根长(root length，RL)用直尺测定；幼苗地上部鲜重(plant shoot fresh weight，PSFW)和幼苗地下部鲜重(plant root fresh weight，PRFW)用分析天平称量；将材料于110℃杀青15 min，85℃烘至恒重，称量幼苗地上部(plant shoot dry weight，PSDW)和地下部干重(plant root dry weight，PRDW)；叶绿素(chlorophyll，CHL)含量采用丙酮-无水乙醇浸提比色法测定。

表1 供试49个芦笋品种信息Table 1 The information of 49 asparagus varieties used in this study

根冠比(rootshoot ratio，RSR)=地下部干重/地上部干重

1.4 数据统计分析

耐盐性用测定指标的耐盐系数来评价，单项耐盐系数(salt tolerance coefficient，SC)和综合耐盐系数(comprehensive salt tolerance coefficient，CSC)分别按照公式(1)和(2)进行计算，并对SC值进行描述统计、相关性分析和方差分析。

SC=盐处理测定值/对照处理测定值

(1)

(2)

i=1, 2,3,…,n；j=1,2,3,…,m

(3)

μ(Xj)=(Xj-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

(4)

(5)

(6)

以D值为参考序列，SC值为比较序列，进行灰色关联度分析。分别按照公式(7)～(10)计算各性状测定指标关联系数[ξi(h)]、关联度(γD)、权重系数[ωi(γ)]和加权耐盐系数(weight salt tolerance coefficient, WSC)。其中，h表示品种编号，△i(h)表示品种h的单项指标i与参考序列指标i的差的绝对值，△min和△max和分别表示二级最小差和最大差，即△i(h)的最小值和最大值，ρ为分辨系数(取值0.5)。

ξi(h)=(Δmin+ρ×Δmax)/[Δi(h)+ρ×Δmax],

h=1,2,3,…,p;i=1,2,3,…,n

(7)

(8)

(9)

h=1,2,3,…,

p；i=1,2,3,…,n

(10)

基于D值进行聚类分析并划分耐盐等级。采用Microsoft Excel 2010软件进行数据整理、隶属函数分析和灰色关联度分析，采用SPSS 21.0软件进行数据统计、主成分分析及聚类分析等多元统计分析。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对芦笋芽期苗期各单项指标的影响

NaCl胁迫对芦笋芽期和苗期各单项指标均产生了极显著影响(表2)，各指标平均耐盐系数(SC)均明显偏离1。与CK相比，处理组发芽率(GR)、发芽势(GP)、芽高(SH)和胚根长(RDL)及苗期株高(PH)、根长(RL)、地上部鲜重(PSFW)、地下部鲜重(PRFW，井冈111除外)、地上部干重(PSDW)和叶绿素(CHL)含量均有所下降(SC<1)，而苗期34个品种的地下部干重(PRDW)和46个品种的根冠比(RSR)则均有所上升(SC>1)。同一指标的耐盐系数在不同品种中存在较大变幅，其中苗期指标的变幅(11.66%～28.87%)明显大于芽期指标(10.49%～21.43%)，说明苗期单项指标具有更强的基因型依赖性。各单项指标的平均耐盐系数、处理值与对照值的相关系数分别介于0.444～1.554 和0.428～0.941，且同一品种不同单项指标的耐盐性排序存在较大差异，说明不同单项指标对NaCl胁迫处理的响应存在明显不同，采用单项指标评价会影响准确性，需综合使用多个单项指标来评价耐盐性。

2.2 各单项指标耐盐系数的相关性分析

相关性分析表明(表3)，芽期单项指标间均存在极显著正相关性(P<0.01)，苗期单项指标间大部分存在显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)相关性，而芽期和苗期指标间绝大多数无明显相关性。其中，根冠比(RSR)与地上部干重(PSDW)和地下部干重(PRDW)分别呈极显著正相关性和极显著负相关性，叶绿素含量(CHL)与株高(PH)和地上部鲜重(PSFW)呈极显著正相关性、与PSDW呈显著正相关性。这说明单项指标描述的耐盐性信息间存在交叉重叠，直接使用难以客观、准确评价，需要采用隶属函数法、主成分分析法、聚类分析法等多元统计方法有效整合单项指标信息，综合评价耐盐性。

表3 盐胁迫下芦笋13个单项指标耐盐系数的相关性Table 3 Correlation of salt tolerance coefficients among 13 single indexes of asparagus under salt stress

2.3 49个芦笋品种的芽期耐盐性综合评价

芦笋芽期单项指标仅有4个，均与耐盐性呈正相关，因此根据单项指标耐盐系数计算单项指标隶属函数值[μ(xj)]及各品种平均隶属函数值(U)，并以U值为参考序列，SC值为比较序列，进行灰色关联度分析，计算芽期加权耐盐系数(WSC)，综合评价芦笋品种芽期耐盐性(表4)。49个品种的U、CSC和WSC值分别介于0.092～0.919、0.419～0.803和0.416～0.801，均值分别为0.623、0.668和0.666，变异系数(CV)分别为28.82%、12.44%和12.50%。据三者值的大小进行排序，得到排序结果基本一致(表4)，三者之间存在极显著相关(P<0.01)(图1)。其中，U值排名为前5位的为特立龙、冠军、绿宝丽、精品阿拉斯和荷兰白笋王，排名后5位的为US825、井冈111、丰岛2、浙丰811和京绿芦3号。基于U值聚类将49个品种芽期耐盐性划分为4个等级(图2)：第一类为强耐盐品种，包括特立龙和冠军2个品种，U值范围为0.914～0.919，占总数的4.08%；第二类为中耐盐品种，包括绿宝丽、精品阿拉斯等25个品种，U值范围为0.656～0.833，占总数的51.02%；第三类为弱耐盐品种，包括紫色阳光、JX1914等18个品种，U值范围为0.404～0.620，占总数的36.74%；第四类盐敏感品种，包括京绿芦3号、浙丰811等4个品种，U值范围为0.092～0.235，占总数的8.16%。

注：R同表2。Note：R same as Table 2.图1 盐胁迫条件下芦笋芽期CSC值、U值和WSC值的相关性分析Fig.1 Correlation analysis of CSC value, U value and WSC value at germination stage of asparagus under salt stress

表4 供试芦笋品种芽期耐盐性评价的CSC值、U值和WSC值Table 4 The CSC, U and WSC value of salt tolerance evaluation in tested 49 asparagus varieties at germination stage

2.4 49个芦笋品种的苗期耐盐性综合评价

2.4.1 苗期主成分分析 苗期单项指标共8项，且彼此间存在一定的相关性，为避免信息重叠，需使用主成分分析法进行降维，共提取出特征根>0.8的主成分3个，分别以F1、F2和F3表示，贡献率分别为40.573%、26.744%和10.488%，累计贡献率为77.805%，即可反映8个单项指标77.805%的信息，符合主成分分析要求(表5)。据各因子载荷可知，主成分(F1)主要代表苗期根长、地下部鲜重、地下部干重和根冠比，主要反应地下部生长情况，可解释F1的94.28%；F2主要代表苗期株高和叶绿素含量，主要反应地上部外观形态，可解释F2的62.16%；F3主要代表地上部鲜重和地上部干重，主要反应地上部质量，可解释F3的61.08%。F1、F2和F3的权重(Wj)分别为0.521、0.344 和0.135。

2.4.2 苗期耐盐性综合评价 以单项指标测定值为基础，计算综合指标值(Xj)、综合指标隶属函数值[μ(Xj)] 和耐盐性综合度量值(D)(表6)。49个芦笋品种幼苗期D值介于0.147～0.718，均值为0.460，CV为35.94%。按D值大小进行耐盐性排序，前5名品种为绿宝丽、京绿芦1号、伊诺斯、全雄奈特和冠军，后5名为新科2030、京紫芦2号、JX1913、UC157和TC。

注：Ⅰ: 强耐盐；Ⅱ: 中耐盐；Ⅲ: 弱耐盐；Ⅳ: 盐敏感。下同。Note：Ⅰ: Strong salt tolerance. Ⅱ: Medium salt tolerance. Ⅲ: Weak salt tolerance. Ⅳ: Salt sensitivity. The same as following.图2 基于U值的49个芦笋品种芽期耐盐性聚类图Fig.2 The clustering dendrogram of salt tolerance in 49 asparagus varieties at germination stage based on U value

图3 盐胁迫条件下芦笋苗期CSC值、D值和WSC值的相关性分析Fig.3 Correlation analysis of CSC value, D value and WSC value at seedling stage of asparagus under salt stress

D值为参考序列，SC值为比较序列，采用灰色关联分析法计算加权耐盐系数(WSC)(表6)。49个芦笋品种幼苗期CSC值和WSC值分别介于0.669～1.054 和0.672～1.070之间，均值分别为0.869 和0.876，CV为12.51%和12.77%。CSC值、WSC值和D值三者间的相关性均达到极显著水平(图3)，排序结果基本一致。49个品种基于D值聚类可划分为4个耐盐等级(图4)：第一类为强耐盐品种，包括京绿芦1号、绿宝丽等12个品种，D值范围为0.609～0.718，占总数的24.49%；第二类为中耐盐品种，包括艾丽丝、JX1914等20个品种，D值范围为0.397～0.565，占总数的40.82%；第三类为弱耐盐品种，包括JX1913、丰岛2号等14个品种，D值范围为0.227～0.361，占总数的28.57%；第四类盐敏感品种，包括新科2030、京紫芦2号等3个品种，D值范围为0.147～0.185，占总数的6.12%。

表5 盐胁迫下芦笋苗期8个单项指标的主成分分析Table 5 Principal component analysis of 8 single indexes of asparagus seedlings under salt stress

2.5 芽期苗期耐盐性综合分析

芦笋芽期、苗期耐盐性不一致(表7)，如京绿芦3号、井冈111在幼苗期表现为强耐盐，在芽期表现为盐敏感；新科2030在芽期表现为中耐盐，在幼苗期表现为盐敏感。同时发现，部分材料虽然芽期苗期耐盐性排序不同，但属于同一耐盐等级，如冠军、特立龙在两时期均表现为强耐盐，华淼、锐力均表现为中耐盐。相关性分析表明，芽期和苗期的耐盐性相关系数为0.159 (P=0.275)，即无显著相关性。

表6 各品种幼苗期综合指标隶属函数值及CSC值、D值和WSC值Table 6 The subordinate function value, CSC value, D value and WSC value of asparagus varieties at seedling stage

图4 基于D值的49个芦笋品种苗期耐盐性聚类图Fig.4 The clustering dendrogram of salt tolerance in 49 asparagus varieties at seedling stage based on D value

3 讨论

3.1 芦笋芽期苗期耐盐性鉴定方法

芦笋属强耐盐植物，是盐碱地开发利用和探索植物耐盐机理的先锋作物[9]。耐盐性的鉴定方法是评价植物耐盐性的基础，影响因素包括鉴定方式、鉴定指标和耐盐性描述等。理想的鉴定方法是在确保准确性的基础上，采取简化鉴定程序和节约鉴定成本等措施，从而实现快速化、便捷化和高效化，并实现大规模资源鉴定。本研究采用营养液水培方式对芦笋芽期苗期耐盐性进行鉴定，水培容器为一次性透明饭盒和一次性透明水杯，具有如下4点优势：一、在芦笋芽期苗期可快速、准确地初筛耐盐品种，大幅减少田间鉴定的成本和工作量[18]；二、水培溶液的盐分浓度较为均匀，可防止土壤或基质栽培中盐分非均匀分布对鉴定结果造成影响；三，可以直观盐胁迫下的根系生长过程，避免土壤或基质栽培在选择代表性植株时对根系造成伤害，防止伤势差异对生长速度造成影响；四、可实现一次性透明饭盒和水杯的废物再利用，降低鉴定成本。

表7 49个芦笋品种的芽期苗期耐盐性综合分析Table 7 Comprehensive analysis on salt tolerance in 49 asparagus varieties at the germination and seedling stage

植物耐盐性由多基因控制，目前已在植物中发现多种耐盐途径，采用多个指标进行耐盐性鉴定更为客观、合理[15-16]。因此，本研究选取发芽率、发芽势等4个芽期形态指标和株高、根长等8个苗期形态和生理指标对芦笋芽期和苗期耐盐性进行鉴定，并采用耐盐系数进行描述，该方法与谢启鑫等[9]和高春华等[11]的方法一致，可消除品种间的固有性状差异，提高鉴定结果的准确性。长势是反映植株生长速度的重要指标，代表性植株的长势是否一致对鉴定结果具有重要影响。同一品种的盐胁迫处理和对照处理的代表性植株长势不一致，说明二者生物量差异不完全由盐胁迫引起，还包括植株生长速度差异因素，即二者性状相对值反映的不完全是耐盐系数，从而降低了鉴定结果的准确性。基于传统经验选择的芦笋代表性植株经培养一段时间后，同一处理不同单株间生物量仍存在较大差异，这说明植株长势不一致，而品种纯度不高则是造成该现象的主要原因，表明该方法不适用于纯度不高的植物类型。本研究提出了代表性植株二次选择法，首次根据株高和根长确定预代表性植株，共同培养一段时间后，可将株高和根长仍一致的植株判定为长势一致的代表性植株。利用该方法选择的代表性植株经培养一段时间后，同一处理不同单株间生物量整齐度大幅提升，说明二次选择法较传统经验判断更为科学、合理，对于提升芦笋耐盐性鉴定的准确性具有一定作用。

3.2 芦笋芽期苗期耐盐性综合评价方法

科学合理的评价体系对植物耐盐性鉴定也至关重要[17]。本研究中，除了幼苗期地下部干重和根冠比外，芽期4个指标和苗期6个指标均不同程度地受到盐胁迫抑制，这与沙枣[18]、啤酒大麦[19]研究结果一致。一方面说明根系补偿生长有助于缓解盐害造成的根系功能损伤，对提高耐盐性具有重要意义；另一方面说明不同指标对盐胁迫反应的敏感性差异较大，响应机制不同，采用单项指标或等权重使用多项指标进行耐盐性评价均会对鉴定结果造成影响。近年来，采用隶属函数法、主成分分析法、聚类分析法等多方法相结合的综合评价体系已广泛应用于芦笋[9]、粒用高粱[11]、陆地棉[14]、甘薯[15]等作物的耐盐性评价。隶属函数法可将各指标值归一化为0～1之间的纯数，同时对各指标的权重进行考量，实现了多个指标间的有效比较。

本研究中，芦笋芽期以U值为主评价指标，排序结果与聚类分析一致，同时，以CSC和WSC值进行辅助评价验证，三者之间呈极显著正相关。芦笋苗期大部分指标间相关性较强，彼此间存在信息重叠。利用主成分降维思想可以将多个相互关联的单项指标浓缩为少数几个相互独立的综合指标，并根据贡献率确定权重，采用综合度量值对复杂性状进行全面准确的评价，使评价结果更加接近种质真实的耐盐性。本研究采用主成分分析法将芦笋株高、根长等8个苗期单项指标转化为3个相互独立的综合指标，以D值为主评价指标，CSC和WSC值为辅助评价指标，三者排序结果基本一致，基于D值采用聚类分析法进行耐盐等级划分，结果与D值排序结果一致。说明该评价体系对芦笋芽期苗期的耐盐性评价结果具有较高可信度，在耐盐性评价中使用D值和聚类分析法即可对芦笋耐盐性进行准确评价。

3.3 芦笋芽期苗期耐盐性比较

植物的耐盐性与生育期有关[20-21]。本研究中，芦笋芽期和苗期的耐盐性存在一定差异，如京绿芦3号、井冈111在苗期强耐盐而芽期盐敏感。本结果与高粱[20]、小麦[21]的研究结果一致，其原因可能是芽期和苗期的耐盐性机制不尽相同，如植物激素介导的种子萌发与芽期耐盐性密切相关[22-24]，而Na+离子区隔化、K+选择性吸收、泌盐等则在苗期耐盐性中发挥重要作用[25]。本研究鉴定出在芽期和苗期耐盐性均较强的品种冠军和特立龙，可用于后续芦笋耐盐机理研究。其中，冠军在谢启鑫等[9]研究中也被鉴定为耐盐类型，并且其强耐盐性在山西忻州盐碱地的生产实践中得到了证实；特立龙尚不能应用于盐碱地规模化种植，主要由于其品种产量除与芽期苗期抗性有关外，仍与作物自身的产量情况及产量指标的耐盐情况密切相关[25-27]，需进一步开展盐碱地全生育期鉴定。

4 结论

本研究结果表明，310 mmol·L-1NaCl胁迫对芦笋芽期和苗期各指标均有极显著影响。本研究提出的代表性植株二次选择与多元统计分析的耐盐性鉴定方法和评价体系可消除代表性植株的长势差异，鉴定结果更为科学、合理，可用于大规模芦笋种质的早期耐盐性鉴定筛选，大幅减少芦笋盐碱地全生育期鉴定的成本和工作量。同时，初步筛选出芽期苗期均表现为强耐盐的芦笋品种2个，可为后续耐盐基因挖掘和耐盐新品种选育提供种质材料。