不同氮素形态配比对三七根腐病的影响

李晴晴 霍莹莹 杨 静 李甜甜 徐福荣 董 鲜

(云南中医药大学中药学院，云南 昆明 650500)

当植物遭遇病原菌侵袭时，活性氧(reactive oxygen species, ROS)累积，以及防御系统启动，防御系统包括酶促系统和非酶促系统[6]。非酶促系统主要通过合成一些次生代谢产物，如酚类、木质素、植保素等来抵抗病原菌[7]。酶系统中，起重要作用的有超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化物酶(peroxidase, POD)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)和苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase, PAL)，上述酶类参与ROS的清除，以及酚类、木质素和植保素等抗病相关物质的合成[8]，能有效抵御ROS对细胞膜系统的伤害，增强植物对病原菌的抵抗能力。

研究表明不同氮素形态对植物防御系统的影响有差异[6,9-10]，对植物的生长也有不同的影响。适宜的铵硝配比能够增加植物的抗病性，促进植物生长，增加生物量以及次级代谢产物的累积[11-13]。

目前三七种植过程中根腐病发生严重，而氮肥施用对三七根腐病影响的相关研究较少。因此，本试验就不同氮素形态配比及病原菌侵染对三七产量、有效成分以及抗性指标的影响展开研究，以期探索出科学的氮肥运筹模式，为三七根腐病的防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三七：健康一年生三七子条由文山景源农业发展有限公司提供。

菌株：尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)，云南中医药大学云南省道地濒危中药材繁育与栽培工程技术研究中心保存菌株。

试剂：三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd(对照品，纯度均为HPLC≥98%)，购于北京索莱宝科技有限公司；甲醇、乙腈(均为色谱纯)，购于德国Meker公司；植物可溶性糖含量检测试剂盒、植物类黄酮含量检测试剂盒、SOD试剂盒、POD试剂盒、PPO试剂盒和PAL试剂盒、植物总酚(total phenols, TP)含量检测试剂盒、木质素含量检测试剂盒和过氧化氢(H2O2)含量检测试剂盒，购于北京索莱宝科技有限公司。

1.2 培养基

马铃薯葡萄糖培养基(potato dextrose agar，PDA)：去皮马铃薯20 g，葡萄糖 20 g，琼脂 20 g，蒸馏水定容至1 000 mL。

Bilay’s培养基：磷酸二氢钾1 g，氯化钾0.5 g，硝酸钾1 g，七水硫酸镁0.5 g，葡萄糖0.2 g，蔗糖0.2 g，淀粉0.2 g，蒸馏水定容至1 000 mL。

1.3 试验设计

1.3.3 孢子悬浮液的制备以及病原菌的侵染 用无菌水将PDA培养基上的尖孢镰刀菌冲洗下来，经过滤用无纺布Miracloth(Millipore)滤掉菌丝，在显微镜下用血球计数板调成所需浓度的孢子悬浮液(1 × 107个·mL-1)， 备用。不同氮素形态配比营养液处理三七两周后，7月5日三七接种尖孢镰刀菌，用注射器将制备好的孢子悬浮液注入三七根部的基质中，每株注射4 mL，未接菌组注入等量无菌水。此时总氮含量为2 mmol·L-1， 试验共10个处理，即：

1.4 测定项目与方法

1.4.1 尖孢镰刀菌菌落直径和孢子浓度的测定 在PDA培养基中分别加入总氮含量为2 mmol·L-1的5种不同氮素形态配比溶液。接种后连续7 d采用十字交叉法测量菌落直径，每个处理5个重复。

在Bilay’s培养基中分别加入总氮含量2 mmol·L-1的5种不同氮素形态配比溶液。灭菌后加入等量的尖孢镰刀菌孢子悬浮液，放于摇床上，180 r·min-1、28℃恒温震荡培养7 d，采用血球计数板统计孢子数量，每个处理4个重复。

1.4.2 叶绿素含量的测定和病情指数的统计 氮素处理54 d后，植株采集前使用SPAD-502叶绿素含量测定仪(Konica Minoita, 日本)测定各处理两年生三七的叶绿素含量并统计病情指数，每个处理4个重复，根据三七病害的发展将发病程度分为0～4个等级：

0级：三七植株生长健康；

1级：三七叶端出现病斑；

2级：植株出现枯黄叶片<50%；

3级：植株出现枯黄叶片>50%；

4级：植株死亡。

按照公式计算病情指数(disease index，Di)：

Di=∑[(Dn×Dg)/(Tn×Mg)]×100

(1)

式中，Dn表示同一病情等级的植株数目，Dg表示相应的病情等级，Tn表示总植株数目，Mg表示最高病情等级。

1.4.3 生物量的测定 氮素处理54 d后进行植株的采集，带回实验室，洗净、擦干水分后将其分为地上部分和地下部分，称重。一部分经液氮冷冻后放于-80℃ 冰箱，备用。另一部分置于40℃烘箱中烘干，称定干重，铜铳粉碎，过65目筛，放于干燥器中，备用，每个处理4个重复。

1.4.4 皂苷含量的测定

1.4.4.1 对照品溶液的制备 分别精密称定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Rb1和Rd四个对照品，甲醇定容至10 mL，配制成以上单体皂苷浓度分别为0.968、1.824、1.758和1.049 mg·mL-1的混合对照品溶液，之后将其逐级稀释，共8个浓度。

1.4.4.2 供试品溶液的制备 精密称定三七地下部分粉末0.1 g，置于试管中，精密加入3 mL甲醇，封口，常温超声提取1h(40 kHz，300 W)，3 000 r·min-1离心10 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜，所得续滤液即为供试品溶液。

1.4.4.3 色谱条件 色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，色谱条件参考《中华人民共和国药典》[1]。流动相为乙腈(A)-水(B)，洗脱程序：0 min，19% A；12 min，19% A；60 min，36% A；77 min，36% A，之后回到初始浓度，保持10 min。流速为0.6 mL·min-1，进样量为10 μL，柱温为30℃，检测波长为203 nm。

1.4.5 可溶性糖和黄酮含量的测定 取保存于-80℃ 冰箱内的三七地下部分鲜样，液氮研磨后使用植物可溶性糖含量检测试剂盒进行测定。取三七地下部分粉样，使用植物类黄酮含量检测试剂盒进行测定，每个处理4个重复。

1.4.6 三七防御酶活性的测定 取三七地上部分鲜样，液氮研磨后使用SOD、POD、PPO和PAL活性检测试剂盒进行测定，每个处理5个重复。

1.4.7 酚类和木质素含量的测定 取三七地上部分粉样，分别使用TP含量检测试剂盒和木质素含量检测试剂盒进行测定，每个处理4个重复。

1.4.8 H2O2含量的测定 取三七地上部分鲜样，液氮研磨后，使用H2O2含量检测试剂盒进行测定，每个处理4个重复。

1.5 数据处理

利用SPSS Statistic 19.00软件对数据进行处理和分析，使用Origin 2018进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同氮素形态配比对尖孢镰刀菌生长的影响

注：A：培养第7天菌落生长情况；B：培养7天菌落生长曲线。下同。Note: A: Colony growth on the seventh day of culture. B: Colony growth curve within seven days. A: N: The same as following.图1 不同氮素形态配比对尖孢镰刀菌生长的影响Fig.1 Effect of different nitrogen forms on the growth of F. oxysporum

表1 不同氮素形态配比对尖孢镰刀菌第7天菌落直径和孢子数量的影响Table 1 Effect of different nitrogen forms on colony diameter and spore content of F. oxysporum on the seventh day

2.2 不同氮素形态配比及病原菌侵染对三七生长的影响

图2 不同氮素形态配比及病原菌侵染对三七生长的影响Fig.2 Effect of different nitrogen forms and pathogen infection on the growth of P. notogensing

表2 不同氮素形态配比及病原菌侵染对两年生三七生长的影响Table 2 Effect of different nitrogen forms and pathogen infection on the growth of two-years P. notogensing

2.3 不同氮素形态配比及病原菌侵染对三七中皂苷含量的影响

注：1：三七皂苷R1； 2：人参皂苷Rg1；3：人参皂苷Rb1；4：人参皂苷Rd。Note: 1: Notoginsenoside R1. 2: Ginsenoside Rg1. 3: Ginsenoside Rb1. 4: Ginsenoside Rd.图3 皂苷对照品(A)和三七样品(B)HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of saponins reference substance (A) and P. notoginseng (B)

表3 不同氮素形态配比以及病原菌侵染对两年生三七皂苷含量的影响Table 3 Effect of different nitrogen forms and pathogen infection on the content of saponins /(mg·g-1)

2.4 不同氮素形态配比及病原菌侵染对三七可溶性糖和黄酮含量的影响

注：不同字母表示不同处理间差异达显著水平(P<0.05)。下同。Note: Different letters indicate significant difference at 0.05 level. The same as following.图4 不同氮素形态配比以及病原菌侵染对两年生三七可溶性糖(A)和黄酮(B)含量的影响Fig.4 Effect of different nitrogen forms and pathogen infection on the contents of soluble sugar(A)and flavonoids(B)

2.5 不同氮素形态配比及病原菌侵染对防御酶的影响

图5 不同氮素形态配比对两年生三七抗病防御酶活性的影响Fig.5 Effects of different nitrogen forms and pathogen infection on the activity of anti-disease defensive enzymes

2.6 不同氮素形态配比及病原菌侵染对酚类和木质素含量的影响

未接菌组酚类及木质素平均含量分别为3.70 mg·g-1和188.74 mg·g-1，不同氮素配比处理含量无显著性差异(图6-A、B)。病原菌侵染使两者含量均增加，此时酚类和木质素平均含量分别为3.95 mg·g-1和217.00 mg·g-1，当铵硝配比为25∶75时，二者升高幅度均达到最大。

图6 不同氮素形态配比及病原菌侵染对酚类和可溶性糖含量的影响Fig.6 Effect of different nitrogen forms and pathogen infection on the contents of phenols and lignin

2.7 不同氮素形态配比及病原菌侵染对H2O2含量的影响

未接菌组H2O2平均含量为7.12 μmoL·g-1，接菌组平均含量为7.13 μmoL·g-1。不同氮素形态配比间H2O2含量无差异，病原菌侵染对H2O2含量无明显影响(图7)。

图7 不同氮素形态配比及病原菌侵染对对H2O2含量的影响Fig.7 Effect of different nitrogen forms and pathogen infection on the content of H2O2

3 讨论

4 结论