一种改良的猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测方法的建立

张鑫玉，吴 琼，张 涛，周 波，温海京，崔德凤*，张永红*

(1.北京农学院动物科学技术学院/兽医学(中医药)北京市重点实验室，北京 102206；2.河北农业大学动物科技学院，保定071000；3.中牧实业股份有限公司，北京 100070)

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)是圆环病毒科圆环病毒属的成员之一，也是目前世界上最小的DNA病毒，其基因组全长1 700 bp左右，包含11个开放阅读框(open reading frame，ORF)。该病毒感染猪可与猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)。此外，PCV2还与猪皮炎与肾病综合征( porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(porcine respiratory disease complex，PRDC)及母猪的生产繁殖障碍等疾病相关。故PCV2已成为严重阻碍养猪业发展的主要病原之一[1-3]。感染PCV2的患病母猪大大降低受孕率，增加感染母猪的流产率，导致可能产下木乃伊胎[4]。由于PCV2感染猪群存在临床发病与亚临床感染，其体内的病毒载量不同，易引起PCV2检测的漏检，出现诊断错误而延误病情[5]。

针对PCV2的检测方法有很多，如酶联免疫吸附试验、病毒分离、聚合酶链式反应等，这些方法都存在着操作烦琐复杂、耗时较长以及检测方法相对敏感性较低等弊端[6]，故而针对PCV2建立一种操作简便、灵敏的、快速的检测方法非常必要。ORF2编码PCV2的衣壳蛋白，是PCV2重要的抗原基因[7]，因此ORF2成为诊断鉴别PCV2的关键靶基因。该研究针对PCV2的ORF2基因设计一对特异性引物，利用SYBR Green荧光染料建立一种快速、灵敏的实验室内PCV2的绝对定量PCR技术检测方法，为临床中PCV2的诊断及流行病学调查提供有效的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材 料

猪圆环病毒1型(porcine circovirus type 1，PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)、猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)、猪博卡病毒(porcine boca virus，PBoV)均由北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室保存。Pure Plasmid Mini Kit高纯度质粒小提试剂盒(CW0548S，北京康为世纪生物科技有限公司)；Pro Taq HS SYBR Green预混型qPCR试剂盒(AG11701， 湖南艾科瑞生物工程有限公司)。ABI step one plus型荧光定量PCR(ABI公司)，4 ℃台式冷冻离心机(Thermo公司)，Nano Drop 2000分光光度计(Thermo公司)。

1.2 引物合成及标准品质粒的制备

根据GenBank中已公布的PCV2序列(NC_005148.1)，由北京擎科生物科技有限公司合成，将目的基因片段645 bp插入PUC57载体，成功构建含有PCV2目的基因片段的PUC57-Cap重组克隆质粒，该质粒作为荧光定量PCR扩增的标准品质粒。根据该基因序列应用Primer 5.0软件设计一对荧光定量PCR扩增引物，扩增引物序列Cap-F是5′-GAGGCGGGCGTTGAAGATGC-3′；Cap-R是5′-AGGAGGCGTTACCGAAGGAGAAG-3′。PCR扩增产物135 bp。该引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.3 荧光定量PCR反应条件的优化

为了建立最适荧光定量PCR检测方法，通过筛选引物浓度及退火温度，提高检测方法的效率。分别取0.2、0.3、0.4和0.5 μmol/L的上游引物、下游引物Cap-F、Cap-R 进行引物浓度的筛选，以105copies/μL的质粒作为模板，通过矩阵法进行荧光定量PCR试验，从而筛选出最佳的引物浓度。进而通过已筛选出的最佳引物浓度，以5.0×105copies/μL的质粒作为扩增模板进行荧光定量PCR反应，调整退火温度区间为63、64、65、66和67 ℃，筛选出最佳的退火温度。

1.4 PCV2荧光定量PCR标准曲线的建立

通过Nano Drop 2000分光光度计测定标准品质粒的吸光度OD280 nm及OD260 nm，计算出重组质粒为5.0×1010copies/μL，连续10倍倍比稀释，以108、107、106、105、104、103、102、101copies/μL这 8个不同浓度梯度的质粒作为模板进行荧光定量PCR检测。反应体系为Pro Taq HS SYBR Green Mix(2×)10 μL，Cap-F 0.4 μL，Cap-R 0.4 μL，Rox 0.4 μL，模板 2 μL，ddH2O补足体系至20 μL。荧光定量PCR反应条件是95 ℃预变性30 s，95 ℃ 15 s，66 ℃ 30 s，采集荧光，40个循环。

1.5 PCV2荧光定量PCR检测方法特异性分析

以PCV1、PRRSV、CSFV、PPV、PBoV的病毒DNA为对照组，以5.0×106copies/μL的标准品质粒为阳性对照，以无菌水为阴性对照，进行PCV2荧光定量PCR检测方法的特异性检测。

1.6 PCV2荧光定量PCR检测方法重复性分析

选取105、104和103copies/μL的标准品质粒进行组间及组内的重复性试验。不同浓度的标准品每组进行3个平行重复试验为组内重复性试验，分别进行3次重复为组间重复性试验。每次所得荧光定量PCR的Ct值的平均值、标准差以及变异系数进行分析。

1.7 PCV2荧光定量PCR与普通PCR敏感性分析

将标准品质粒模板10倍倍比稀释，用不同浓度梯度的标准品进行常规PCR扩增及荧光定量PCR扩增，分析两种方法的最低检出量，比较两种方法的敏感性差异。

1.8 临床样本检测

对已知临床背景有PCV2发病史的猪场采集到的30份样本，包括6份血液样本和24份环境样本进行PCV2流行病学调查。用已建立的荧光定量PCR方法进行检测，同时与常规PCR检测方法进行对比，分析差异。

2 结 果

2.1 荧光定量PCR反应体系的优化

采用矩阵法筛选出0.2、0.3、0.4和0.5 μmol/L中的最优浓度。Cap-F/Cap-R均为0.4 μmol/L时，对106copies/μL的标准品质粒进行荧光定量PCR扩增可获得较小Ct值，且获得的扩增曲线优于其他浓度，故而最终引物浓度选择0.4 μmol/L，见图1。

图1 引物浓度优化结果Fig.1 The results of primer concentration optimization

荧光定量PCR扩增反应退火温度优化结果见表1，在66 ℃时可获得较小Ct值，因此确定最佳退火温度为66 ℃。

表1 退火温度优化数据Tab.1 Annealing temperature optimization data

2.2 荧光定量PCR标准曲线的建立

荧光定量PCR标准曲线见图2。所得线性方程Y=-3.137X+29.85，该检测方法的扩增效率105.403%，反应的相关系数R2=0.999。在实时荧光定量PCR反应结束后，针对其溶解曲线进行分析，结果见图3。扩增产物的熔解温度是89.74 ℃，未出现由于引物二聚体及其他非特异性扩增产物等原因导致的其他峰值。该结果符合荧光定量PCR技术要求，可以用于PCV2的绝对定量分析。

图2 荧光定量PCR检测方法的标准曲线Fig.2 Standard curve of real-time fluorescence quantitative PCR

图3 荧光定量PCR检测方法的熔解曲线Fig.3 Melting curve of real-time fluorescence quantitative PCR

2.3 荧光定量PCR检测方法的敏感性结果

检测方法的敏感性是评估该检测技术灵敏性的重要指标，故而针对常规PCR与实时荧光定量PCR两种检测方法的敏感性进行比较分析。将阳性标准品质粒10倍倍比稀释，常规PCR扩增结果的最低检出量5.0×104copies/μL(图4)，而实时荧光定量PCR检测方法在5.0×101copies/μL时仍有扩增，说明实时荧光定量PCR检测方法比常规PCR方法灵敏1 000倍。

2.4 荧光定量PCR检测方法的特异性结果

根据已建立的实时荧光定量PCR检测方法，对PCV1、PRRSV、猪CSFV、PPV、PBoV及PCV2病毒核酸进行检测。只有PCV2在Ct值为20左右时出现S形曲线，而检测的其他样本均未扩增，判定结果为阴性，见图5。该试验建立的荧光定量PCR方法的特异性较强，未出现假阳性，可以用于后续临床样本分析。

注：M是Maker；1是5.0×107 copies /μL；2是5.0×106 copies /μL；3是5.0×105 copies/μL；4是5.0×104copies/μL；5是5.0×103 copies/μL；6是5.0×102 copies/μL；7是5.0×101 copies/μL。Note: M is Marker; 1 is 5.0×107 copies/μL; 2 is 5.0×106 copies/μL; 3 is 5.0×105 copies/μL; 4 is 5.0×104 copies/μL; 5 is 5.0×103 copies/μL; 6 is 5.0×102 copies/μL; 7 is 5.0×101 copies/μL.图4 常规PCR检测结果Fig.4 PCR test results

图5 实时荧光定量PCR特异性结果Fig.5 Specific results of real-time fluorescence quantitative PCR

2.5 荧光定量PCR检测方法的重复性分析

荧光定量PCR检测方法的重复性试验见表2。组内和组间变异系数均小于0.05。已建立的荧光定量PCR检测方法具有较高的稳定性。

表2 实时荧光定量PCR重复性试验Tab.2 Repeatability of real-time fluorescence quantitative PCR

2.6 临床样本检测

根据该研究建立的荧光定量PCR检测方法和常规PCR方法，对已知临床背景有PCV2发病史的猪场采集到的30份样本，包括6份血液样本和24份环境样本进行PCV2流行病学调查。常规PCR检测结果10份样本阳性，阳性率33.3%。荧光定量PCR检测结果19份样本阳性，阳性率63.3%，结果见表3。该研究所建立的荧光定量PCR检测方法比常规PCR检测方法的检出率高出30.0%，说明该方法具有较好的灵敏性，并且可以实现定量分析样本中的病毒载量，能够适用于猪场内PCV2病毒的疫情检测及疫病的筛查工作，为实验室内检测PCV2提供有效的技术支持。

表3 临床样本检测结果Tab.3 Test results of clinical samples

3 讨 论

近几年来，随着养殖业的快速发展，大型规模化养猪场随之增多，针对猪场的各类疫情防控尤为重要。目前PCV2早已在全球范围内广泛流行，给全球养猪业带来不利影响，造成极其严重的经济损失。建立一种操作简便、快速有效的检测猪圆环病毒2型病毒的方法，监测PCV2的传播、流行及防控具有十分重要的意义。传统病毒的分离检测方法耗时较长，不能为临床诊断提供较为快速准确的数据。常规PCR对反应条件要求较高，并且容易出现引物二聚体等副产物，大大影响试验结果的准确性[8]。实时荧光定量PCR技术是由Applied Biosystems公司研发出的一种可用于定量检测的技术，常用的有荧光染料SYBR Green和荧光标记Taqman探针，可实时定量监测反应过程中的产物扩增变化，灵敏性高，特异性强且能快速定量检测出结果[9]。

该研究建立的荧光定量PCR检测方法根据ORF2基因设计引物。ORF2位于PCV2病毒基因组的互补链上编码具有高度免疫原性的Cap蛋白。Cap蛋白在PCV2病毒的致病性中起重要作用[10]，有研究表明，Cap蛋白可以使感染PCV2的猪产生大量抗体，故而Cap蛋白成为检测PCV2的重要抗原[11]。该研究根据SYBR Green染料法建立的荧光定量PCR检测方法的标准曲线方程Y=-3.137X+29.85，R2为0.999，说明该试验线性关系良好；扩增效率105.403%，说明该方法的扩增效率优异；熔解曲线在89.74 ℃时只出现了单峰，说明引物特异性强，没有出现引物二聚体等副产物；该方法的组间及组内的变异系数均小于0.05%，说明具有良好的稳定性及重复性；该方法PCV2最低检出量5.0×101copies/μL，比常规PCR检测方法的灵敏度高1 000倍。将已建立的绝对定量荧光PCR检测方法用于临床样本检测，并且与常规PCR进行对比，常规PCR检测30个样本，其中10个样本为阳性，绝对定量荧光PCR检测30个样本，其中19个样本为阳性。绝对定量荧光PCR的检出率明显高于常规PCR，该试验建立的检测方法具有更强的灵敏性，为后续用于临床检测PCV2提供有效的技术支持。

石林等[12]根据ORF1设计引物，建立的PCV2 Taqman实时荧光定量PCR检测方法的最低检测值8.828×106copies/μL；于静等[5]根据ORF2建立的SYBR染料荧光定量PCR检测方法的最低检测值1×102copies/μL；郭慧娟等[13]建立的Taqman荧光定量PCR检测方法的最低检出量4.53×102copies/μL。该研究建立的猪圆环病毒2型绝对定量PCR检测方法为荧光定量PCR检测猪圆环病毒2型方法的一个补充，灵敏度高于石林等[12]和于静等[5]及郭慧娟等[13]的研究结果。相较于徐通等[14]建立的常规PCR方法，该试验操作简单、耗时较短、可定量检测出病毒浓度，且不易产生气溶胶污染等问题，有效降低了生物安全风险，同时可进行大批量样本的快速检测。可为临床中感染发病及处于亚临床状态中的生猪进行早期诊断、疫病的筛查、探索PCV2的发病规律及其流行的特点，为PCV2的早期发现治疗赢得时间，大大减少因PCV2爆发感染导致的猪场经济损失。