桂枝复方水煎液和大黄复方水煎液体外对猪圆环病毒2型抗病毒效果初探

温海京，周双海，吴 琼，张 涛，周 波，张鑫玉，张永红*，崔德凤*

(1.北京农学院动物科学技术学院/兽医学(中医药)北京市重点实验室，北京 102206；2.河北农业大学动物科技学院，保定071000；3.中牧实业股份有限公司，北京100070)

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)是现今生猪养殖产业体系中重点防控的传染病原体之一。PCV2感染后可诱发一系列疾病，如断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)、猪皮炎与肾病综合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(porcine respiratory disease complex，PRDC)、增生性坏死性间质性肺炎、非化脓性心肌炎与坏死性心肌炎以及繁殖障碍等生殖系统疾病，这些疾病现被统称猪圆环病毒相关疾病(porcine circovirus associated disease，PCVAD)，属中国二类动物疫病[1]。猪罹患PCVAD后，多表现为生长发育不良、消瘦，皮肤黏膜等苍白或黄疸，呼吸障碍，体表淋巴结肿大，多系统炎症等。种猪与60日龄以内的低龄仔猪均为PCV2感染的高度易感对象与重点保护对象，尤其是20日龄以内的低龄仔猪，在感染PCV2后致死率几乎可高达100%[2]。PCV2感染均会导致病猪产生严重的免疫抑制，现已对世界生猪养殖业造成不容小觑的经济损失。

中药是中国灿烂文化的瑰宝，自千年前中药就已应用于强身健体、治疗疾病，近年来，伴随着近现代科学技术飞速的发展，单味中药、复方药及中药单体等制剂在临床上的应用越来越广泛，临床上已有多项研究表明，诸如黄芪、苦参、板蓝根等中药均具有一定程度的抗PCV2感染作用[3-5]。研究表明，中药桂枝复方中的桂枝-生姜联用具有抗病毒作用[6]；白芍可作为抗流感病毒、疱疹病毒的兽用中草药[7]。大黄复方中的大黄、大青叶、黄芪等均为可抑制病毒生长的中草药且已投入到畜禽养殖中[7]。鉴于此，该研究采用PCR技术对采集某猪场疑似PCV2感染的组织病料分离培养后鉴定，猪肾细胞(PK-15细胞)体外感染其病毒，选取桂枝复方水煎液和大黄复方水煎液处理细胞，探讨桂枝复方水煎液和大黄复方水煎液对分离鉴定的PCV2抗病毒效果，目的为生猪养殖业临床中对PCV2的防治提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材 料

疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征组织病料采集自某猪场并保存于北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室；PK-15细胞由北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室保存；桂枝、白芍、白术、附子、干姜、甘草、大黄、大青叶、蒲公英、青蒿、连翘、栀子、千里光、生石膏、黄苓、黄芪均购自北京同仁堂药店永旺分店；DMEM、胰酶、青链霉素双抗、胎牛血清均购自Gibco公司；PBS、TAE、GoldenView核酸染料、CCK8细胞活力检测试剂盒、Marker购自北京索莱宝科技有限公司；病毒核酸提取试剂盒、2×Pro Taq预混液、荧光定量SYBR Green预混液购自湖南艾科瑞生物有限公司；引物及琼脂糖凝胶粉购自北京擎科生物有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 病料的处理及PCR扩增 取疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征的组织病料，充分剪碎后，加入1 mL生理盐水于组织匀浆器内制成匀浆组织，转移至离心管后，4 ℃ 下6 000 r/min离心10 min，收集上清液，根据病毒核酸提取试剂盒说明书提取样品DNA，置于-20 ℃保存。

使用特异性引物(F为GCGGGCCAAAAAAGGTACAGTTCC；R为ACCAGCGCACTTCGGCAGCG GCAG)对PCV2的ORF2基因进行20 μL体系的PCR扩增反应，目的基因片段790 bp。PCR扩增体系为2×Pro Taq预混液10 μL，上游引物和下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板2 μL，No-RNase水6 μL；反应条件为94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35个循环，72 ℃延伸7min。取5 μL扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件110 V、30 min。

1.2.2 PCV2的分离与培养 选取PCR结果为PCV2核酸阳性的病料，与含有双抗的DMEM经研磨器制成组织匀浆后，反复冻融3次，离心获得的上清液经0.22 μm滤器过滤除菌后，按照1∶10的比例接种于长势良好的PK-15细胞，吸附1.5 h，加入含2%胎牛血清的培养液，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱内继续培养48 h。连续盲传6代，收获F6代细胞培养物，反复冻融3次，1 500 r/min离心7 min，吸取上清液即为培养病毒液。

1.2.3 PCV2分离株ORF2基因序列遗传进化分析 提取病毒培养物内50 μL的DNA进行PCR扩增反应：2×Pro Taq预混液25 μL，上游引物和下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板5 μL，No-RNase水16 μL；反应条件同“1.2.2”。取5 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，剩余产物交由北京擎科生物有限公司进行测序，利用MEGA-X 10.2.5软件将该分离株(命名为BY株)与GenBank中PCV2分离株和其他可引起相似临床呼吸道症状的病毒，如猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory disease virus，PRRSV)和猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)的ORF2基因、猪圆环病毒1型(porcine circovirus type 1，PCV1)、猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3，PCV3)、猪圆环病毒4型(porcine circovirus type 4，PCV4)、不同基因型的PCV2基因进行序列比对，绘制基因进化树，分析其同源性。

1.2.4 病毒细胞半数感染量(TCID50)测定 将状态良好的PK-15细胞接种于96孔板中培养24 h，待细胞长至单层后，弃去孔中的培养基，分别向每孔中加入200 μL经10倍梯度倍比稀释的病毒液(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7)，每个稀释度设置8个重复，置于37 ℃5%CO2培养箱培养48 h，反复冻融3次，1 500 r/min 离心7 min，分别吸取上清，提取各孔病毒DNA，经PCR扩增与电泳，记录各稀释度下阳性孔数量，根据Reed-Muench公式计算出TCID50。

1.2.5 PCV2体外增殖规律测定 6孔板内接种100TCID50病毒液覆盖至细胞表面，37 ℃5%CO2培养箱孵育1.5 h，孵育过程中每15 min晃动1次，1.5 h后加入2%维持培养基继续置于培养箱中培养12、24、48和72 h后提取病毒DNA，将不同时间的病毒培养产物DNA样品与10倍梯度稀释的自建质粒标准品进行绝对定量PCR扩增，反应体系为10 μL 的2×SYBR GREEN MIX，上游引物和下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，ROX(20 μmol/L) 0.4 μL，模板2 μL，6.8 μL的RNase free water；程序为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，66 ℃退火30 s，40个循环。分析不同培养时间内病毒载量，绘制病毒生长曲线。

1.2.6 桂枝复方水煎液和大黄复方水煎液的制备 桂枝复方水煎液：按配比称取桂枝、白芍、白术、附子、干姜、甘草共500 g，置于3倍体积超纯水中浸泡2 h后，武火煎至沸腾后转文火继续煎煮30 min，过滤药渣得到药液，药渣继续添加3倍体积超纯水，同样方式煎煮30 min，合并2次提取药液，旋转蒸发水分，将药液浓缩至500 mL，即得到1 g/mL桂枝复方水煎液。将药液先后置于16层纱布脱脂棉、4层滤纸，1 000 r/min离心10 min，吸取药液上清，先后使用0.45 μm与0.22 μm微孔滤膜除菌，最终得到生药含量1 g/mL无菌桂枝复方水煎液，置于4 ℃暂存备用。

大黄复方水煎液：按配比称取大黄、大青叶、蒲公英、青蒿、连翘、栀子、千里光、生石膏、黄苓、黄芪共500 g，大黄打粉并置于沸水中浸泡30 min，其余各中药成分置于3倍体积超纯水中浸泡2 h后，合并大黄浸出液与其他中药，同桂枝复方水煎液的处理方法获得生药含量为1 g/mL无菌大黄复方水煎液。

1.2.7 桂枝复方水煎液和大黄复方水煎液安全质量浓度测定 设置空白对照组、细胞对照组、桂枝复方水煎液组、大黄复方水煎液组。

空白对照组内只添加DMEM培养液。细胞对照组添加细胞及DMEM培养液。桂枝复方水煎液组：将100 mg/mL的桂枝复方水煎液用DMEM依次进行2倍倍比稀释至100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39和0.20 mg/mL。大黄复方水煎液组：将20 mg/mL的大黄复方水煎液用DMEM依次进行2倍倍比稀释至20.00、10.00、5.00、2.50、1.25、0.63、0.31、0.16、 0.08和0.04 mg/mL。

向96孔板内的PK-15细胞各加入200 μL的桂枝复方水煎液(质量浓度分别为100.00、 50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39和0.20 mg/mL)或大黄复方水煎液(质量浓度分别为20.00、10.00、5.00、2.50、1.25、0.63、0.31、0.16、0.08和0.04 mg/mL)，细胞对照组及空白对照组加入200 μL的DMEM。37 ℃5%CO2培养箱培养48 h后，弃去孔内的培养基，每孔加入100 μL的DMEM与10 μL的CCK-8试剂，继续孵育1 h，读取各孔OD450 nm值，根据公式计算各孔细胞活力，公式如下：

细胞存活率=(桂枝复方水煎液组OD450 nm值-空白对照组OD450 nm值)/(细胞对照组OD450 nm值-空白对照组OD450 nm值)×100%

细胞存活率=(大黄复方水煎液组OD450 nm值-空白对照组OD450 nm值)/(细胞对照组OD450 nm值-空白对照组OD450 nm值)×100%

1.2.8 桂枝复方水煎液和大黄复方水煎液抗PCV2作用试验 在细胞安全范围内桂枝复方水煎液分为4组即对照组(0.00 mg/mL)、低剂量组(1.56 mg/mL)、中剂量组(3.13 mg/mL)和高剂量组(6.25 mg/mL)；大黄复方水煎液分为4组即对照组(0.00 mg/mL)、低剂量组(1.25 mg/mL)、中剂量组(2.50 mg/mL)和高剂量组(5.00 mg/mL)。

分别以3种不同方式处理PK-15细胞，进行抗PCV2作用试验。

预防作用(先加药后加毒)：低剂量组、中剂量组和高剂量组每孔加入1 mL桂枝复方水煎液或大黄复方水煎液，对照组加入1 mL的DMEM；置于37 ℃5%CO2培养箱中孵育1.5 h，弃液后每孔加入1 mL的100TCID50PCV2病毒液，继续培养1.5 h后，弃去孔中培养基；将所有孔内的细胞培养物反复冻融3次，1 500 r/min离心10 min获得上清液，提取病毒核酸，进行荧光定量PCR绝对定量法测定，比较各孔内的病毒载量，分析桂枝复方水煎液和大黄复方水煎液体外对PCV2的预防作用。

杀灭作用(药与毒同时作用)：低剂量组、中剂量组和高剂量组的桂枝复方水煎液或大黄复方水煎液与100TCID50PCV2病毒液1∶1混合，对照组使用DMEM与病毒液混合；置于37 ℃5%CO2培养箱中孵育1.5 h后接种1 mL于PK-15细胞中继续培养1.5 h，弃去孔中培养基，所有孔内细胞培养物反复冻融、离心、核酸提取及荧光定量PCR扩增，得到各孔内病毒载量，分析桂枝复方水煎液和大黄复方水煎液体外对PCV2的杀灭作用。

治疗作用(先加毒后加药)：每孔加入1 mL 100TCID50PCV2病毒液，置于37 ℃5%CO2培养箱中孵育1.5 h，弃液。低剂量组、中剂量组和高剂量组每孔加入1 mL桂枝复方水煎液或大黄复方水煎液，对照组加入1 mL的DMEM；继续培养1.5 h后弃去孔中培养基，将各孔内细胞培养物反复冻融、离心、核酸提取和荧光定量PCR扩增，根据各孔内病毒载量比较桂枝复方水煎液和大黄复方水煎液体外对PCV2的治疗作用。

1.3 试验结果统计分析

试验数据均采用SPSS 25.0软件进行统计处理，使用单因素方差分析组间数据的差异显著性，P<0.05具有统计学意义。

2 结 果

2.1 PCV2分离鉴定及培养

2.1.1 PCV2分离鉴定 采用PCR法对某猪场采集的组织样品分离及检测，结果见图1。5份病料中有1份病料组织样品中出现特异性扩增条带，约790 bp，与阳性对照引物扩增条带结果一致，由此判定该猪场有猪感染PCV2(图1)。将阳性样品PCV2分离株BY株接种于无PCV污染的PK-15细胞中连续盲传6次，取F6代细胞培养物进行PCR检测，结果F6代的扩增及电泳结果与PCV2阳性对照结果一致(图2)。为深入了解阳性样品PCV2分离株基因及株型情况，将PCV2分离株BY株F6代细胞培养物ORF2基因的PCR扩增产物进行测序，应用NCBI内的BLAST对测序结果进行基因序列比对分析，图3是BY株序列系统进化情况。采用MEGA-X 10.2.5软件对BY株ORF2基因与PCV2、PCV1、PCV3、PCV4、PRRSV、PPV的基因序列进行遗传进化分析，图3A显示BY株ORF2基因序列与GenBank中已收录的PCV2序列同源性达到99.47%～99.60%， BY株与PCV2有较近的亲缘关系，BY分离株为PCV2毒株，与其他病毒遗传关系较远；再次将BY株基因组与GeneBank内PCV2的2a-2f不同分型的序列[8-9]进行比对分析，图3B显示BY株属PCV2d型。

注：M是Marker；1是阴性对照；2是阳性对照；3-7是病料样品。Note: M is Marker; 1 is negative control; 2 is positive control; 3-7 is samples of diseased materials.图1 疑似PMWS病料检测Fig.1 Detection of suspected PMWS materials

注：M是Marker；1是阳性对照；2是BY株F6代培养物。Note: M is Marker; 1 is positive control; 2 is F6 culture of BY.图2 BY株F6代培养物PCR检测Fig.2 PCR detection of F6 culture of BY

2.1.2 PCV2培养及生长特性分析 采用普通PCR法测定PCV2 F6代培养物的病毒滴度，计数每个病毒稀释度下的PCV2阳性孔与阴性孔，根据Reed-Muench法计算出病毒的TCID50为10-4.3/0.1 mL(表1)。

注：A为BY株ORF2基因序列系统进化树分析；B为BY株PCV2基因分型系统进化树分析。Note:A is the phylogenetic tree analysis of ORF2 gene sequence of BY; B is the phylogenetic tree analysis of PCV2 genotyping of BY.图3 BY株序列系统进化树分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of F6 generation of BY

表1 PCV2的TCID50测定Tab.1 TCID50 determination of PCV2

采用建立的绝对定量的方法检测100TCID50PCV2感染不同时间点细胞内病毒cap基因的表达量如图4所示。cap基因的表达量随时间逐渐增加，在48 h达到高峰后逐渐下降，因此，在后续试验中采用48 h作为PCV2感染后的孵育时间点。

2.2 桂枝复方水煎液和大黄复方水煎液体外对分离鉴定的PCV2抗病毒效果

2.2.1 对PK-15细胞活力的影响 将不同质量浓度的桂枝复方水煎液和大黄复方水煎液分别作用于生长良好的PK-15细胞，根据酶标仪测定的OD450 nm值，计算细胞活力(图5)。12.50 mg/mL的桂枝复方水煎液可对细胞造成一定的毒性损伤作用，且随着质量浓度的升高，细胞活力逐渐降低；5.00 mg/mL及以下质量浓度的大黄复方水煎液对细胞的生长无损伤作用。

注：A为PCV2 cap基因绝对定量检测方法标准曲线；B为PCV2的生长曲线。Note: A is the standard curve of PCV2 cap gene absolute quantitative detection method; B is the growth curve of PCV2.图4 PCV2在PK-15细胞中的复制Fig.4 Replication of PCV2 in PK-15 cells

图5 CCK8法筛选桂枝复方水煎液和大黄复方水煎液对PK-15细胞的安全质量浓度Fig.5 CCK8 method for screening the safe concentration of CassiaTwig compound decoction and Rhubarb compound decoction on PK-15 cells

2.2.2 对PCV2的防治作用 绝对定量法可获得每个样品中的PCV2载量，6.25 mg/mL的桂枝复方水煎液体外对猪圆环病毒2型具有显著的预防作用(P<0.05)(图6A)及极显著的治疗作用(P<0.01)，3.13 mg/mL的桂枝复方水煎液可显著降低细胞内猪圆环病毒2型的复制(P<0.05)(图6C)，桂枝复方水煎液不具有体外直接杀灭猪圆环病毒2型的能力(图6B)。5.00 mg/mL的大黄复方水煎液体外对猪圆环病毒2型具有显著的预防作用(P<0.05)(图6A)及极显著的杀灭作用(P<0.01)，2.50 mg/mL的大黄复方水煎液可直接参与杀灭猪圆环病毒2型，显著降低细胞内该病毒的载量(P<0.05)(图6B)，大黄复方水煎液体外对猪圆环病毒2型感染后的治疗作用不佳(图6C)。

注：A为预防作用；B为杀灭作用；C为治疗作用；桂枝复方水煎液与对照组相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；大黄复方水煎液与对照组相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01。Note: A is thepreventive effect; B is the killing effect; C is the therapeutic effect; compared with the control group and the CassiaTwig compound decoction, * means P<0.05, ** means P<0.01; compared with the control group and the Rhubarb compound decoction, # means P<0.05, ## means P<0.01.图6 桂枝复方水煎液和大黄复方水煎液体外对PCV2的防治作用Fig.6 The preventive effect of PCV2 of Cassia Twig compound decoction and Rhubarb compound decoction in vitro

3 讨 论

近20年PCV2的感染一直处于多地区、高感染的态势，且显性、隐性感染均出现稳步上升趋势，虽然疫苗的使用可在一定时间内显著减轻感染猪的临床症状，降低PCV2在猪群中的流行性和败血症的发生率，但随着PCV2的不断变异，新变异毒株的出现使得PCV2的流行情况有所提升[10]。目前PCV2可分为5个基因亚型，即2a、2b、2c、2d和2e[11]，2018年又增加了PCV2f型[12]，PCV2流行的毒株在2003年由PCV2a逐渐转型为2b型，直到2012年PCV2d逐渐取代PCV2b成为近年来的流行毒株[13-14]。

该研究收集某猪场疑似PMWS病料，经PCR特异性扩增，鉴定为PCV2阳性，无菌处理后接种于无污染的PK-15细胞中，该病毒可在其中进行体外生长，盲传6代后，经PCR与基因测序分析确定为PCV2且TCID50可达到10-4.3/0.1 mL。ORF2基因序列比对可知，分离的病毒BY株能够与可引起相似呼吸道疾病的PPV、PRRSV及其他基因分型的猪圆环病毒区分开来，由此证明分离到的BY株确定为PCV2，同时PCV2毒株BY株与GeneBank内的不同基因亚型的序列进行比对，结果分离株为PCV2d型，与当前流行趋势相符，其中新增PCV2f分型的加入，增加了分析数据的全面性。

现代药理学研究表明，黄芪、黄芩、青蒿等位列兽医常用十大抗病毒中药[15]；具有清热解毒功效的连翘、大青叶、蒲公英等可直接参与杀灭病毒，且在抑制病毒的复制、阻断其吸附作用方面具有显著功效[16]；甘草、白芍、白术等可调动全身的免疫防御系统，通过间接作用发挥其对宿主细胞的保护能力[17]。

该试验选用的桂枝复方水煎液和大黄复方水煎液包括多种抗病毒中草药成分，大黄复方水煎液包含大黄、大青叶、蒲公英、青蒿、连翘、栀子、千里光、生石膏、黄苓、黄芪，桂枝复方水煎液包含桂枝、白芍、白术、附子、干姜、甘草。桂枝复方水煎液和大黄复方水煎液均具有一定的体外抗PCV2能力，抗病毒效果与使用剂量存在一定关联，不同给药顺序呈现出不同的抗病毒作用，桂枝复方水煎液以PCV2感染后的治疗作用为主，大黄复方水煎液以对PCV2杀灭作用为主，二者均可投入到进一步的临床作用研究。