北京市昌平地区园林植物烟草花叶病毒的检测

刘羽丰，徐晨曦，吴 泽，杨爱珍，任俊达*，尚巧霞*

(1.北京农学院生物与资源环境学院/农业农村部华北都市农业重点实验室，北京 102206；2.北京市海淀区圆明园管理处，北京 100084)

烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)属帚状病毒科(Vigaviridae)烟草花叶病毒属(Tobamovirus)，病毒粒子为杆状，大小为18 nm×300 nm。TMV病毒粒子异常稳定，其侵染性能保持数十年，可以通过机械接种传播[1]。该病毒寄主范围较广泛，在茄科植物中较常见，最容易为害烟草和番茄，此外，还能侵染400 余种植物，引起重要病害[2]。TMV的核酸为+ssRNA，全长6 395 nt左右，编码4种蛋白：126 kDa和183 kDa复制酶蛋白、30 kDa细胞间运动蛋白(MP)和17.5 kDa外壳蛋白(CP)[3-4]。其中，TMV的126 kDa蛋白可以抑制寄主植物的转录后基因沉默(PTGS)[5]；TMV外壳蛋白与症状的诱导和病毒粒子的长距离移动有关[6]。研究表明，TMV有很多株系，没有统一的划分标准，各划分间也存在地理隔离[7]。例如世界上的TMV可分为4个类群，而中国的TMV株系则有很多[1,8]。防治TMV所致植物病害主要依靠抗病品种和无毒健苗。

近年来，血清学和RT-PCR方法被广泛应用于TMV的检测[9-10]。中国对园林植物在滞尘能力、重金属含量和缓解城市“热岛效应”等方面研究较多[11-13]，对TMV在园林植物中的发生情况等研究较少。该研究用间接酶联免疫吸附测定方法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、RT-PCR方法和序列测定分析技术检测北京市昌平地区园林植物，明确北京园林植物TMV的发生情况，为园林植物病毒病的相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料

2020年12月9日从北京市昌平地区北京农学院(116°32′E，40°10′N)的园林植物中采集有类似病毒症状的不同种类叶片共8种植物样品，分别为大叶黄杨(Buxussp.)、早熟禾(Poasp.)、棣棠花(Kerriasp.)、鸢尾(Irissp.)、月季(Rosasp.)、桃树(Amygdalussp.)、海棠(Malussp.)和女贞(Ligustrumsp.)。大叶黄杨和海棠的叶片症状是坏死斑，早熟禾、棣棠花和鸢尾的叶片症状是花叶，月季、桃树和女贞的叶片症状是斑驳。

1.2 主要试剂

烟草花叶病毒抗血清由中国农业大学惠赠；酶标羊抗兔IgG购自北京博奥森生物技术有限公司；EASYspin植物RNA快速提取试剂盒、PCR Mix、琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司；dNTPs、5×M-MLV逆转录反应缓冲液、M-MLV反转录酶、RRI抑制剂购自Takara 公司。

1.3 间接ELISA检测

设有4种样品：植物样品为采集的北京市昌平地区8种园林植物有类似病毒症状的叶片、空白样品为包被缓冲液样品(NaHCO32.93 g，Na2CO31.59 g，加蒸馏水至1 000 mL)、阴性对照为已知的无病毒健康烟草样品、阳性对照为已知的带烟草花叶病毒的烟草样品，每种样品重复 3 次。

称取待测植物样品放入装有钢珠的2 mL离心管，经液氮充分研磨后，加20倍体积的包被缓冲液，4 ℃ 下11 000 r/min 5 min。在酶联板上加入上清液，37 ℃培养2～3 h。清除酶联板上的溶液，用装有洗涤缓冲液的洗涤瓶冲洗3次，每次静置3 min，清除酶联板的水分。加入稀释 4 000 倍的TMV抗血清，37 ℃培养 2～3 h；洗涤3次。加入稀释5 000倍的酶标羊抗兔IgG缓冲液，37 ℃培养2～3 h；洗涤3次。配置底物溶液，加入酶联板中，室温培养1 h显色。根据颜色深浅，记录结果。

1.4 RT-PCR检测

1.4.1 植物总RNA提取 使用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒，称取100 mg植物样品于2 mL离心管中，加钢珠放入液氮中，充分冷却后用混合研磨仪进行震荡研磨，重复2次至细粉状。加500 μL裂解液和50 μL植物RNA助提剂于离心管中，快速振荡；56 ℃水浴3 min，13 000 r/min 10 min。取400 μL上清与200 μL无水乙醇混合，13 000 r/min 2 min，弃废液。加700 μL去蛋白液，室温静置1 min，13 000 r/min 30 s，弃废液。加500 μL漂洗液，13 000 r/min 30 s，弃废液；重复 1 遍；取吸附柱置于空收集管中，13 000 r/min 2 min。取吸附柱放入1.5 mL离心管中，加35 μL无酶水，室温静置2 min，12 000 r/min 1 min，获得总RNA。

1.4.2 反转录反应 以1.5 μL提取的总RNA为模板，加入随机上游引物和下游引物各 0.5 μL、dNTP 2 μL，用DEPC水将体系补至 15.5 μL。65 ℃水浴 5 min，冰浴 5 min。加5×M-MLV 逆转录反应缓冲液 4 μL、M-MLV反转录酶和 RRI 抑制剂各0.5 μL。42 ℃ 1 h，70 ℃ 15 min。合成的cDNA 于-20 ℃保存。

1.4.3 PCR扩增、克隆与测序 参照孙晓辉等[14]设计的检测引物TMV F和TMV R。TMV F序列为 5′-GCCGACCCAATAGAGTTA-3′，TMV R序列为5′-GAGGTCCAAACTAAACCAGAAG-3′。

以2 μL cDNA为模板，加入上游引物和下游引物，进行PCR扩增。PCR反应条件为 94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，退火50 ℃ 40 s，72 ℃延伸60 s，35个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳验证，目的片段长度为410 bp。

1.5 序列测定与分析

使用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒回收RT-PCR扩增产物，连接到pBM-23克隆载体，送交北京博迈德基因公司进行序列测定。测序结果与NCBI已报道的序列进行比对，使用MEGA 7.0软件的最大似然法(Maximum Likelihood)构建系统进化发育树。

2 结果与分析

2.1 间接ELISA检测结果

北京市昌平地区8种园林植物样品的间接ELISA检测结果显示，桃树(Amygdalussp.)和海棠(Malussp.)样品含有TMV，大叶黄杨(Buxussp.)、早熟禾(Poasp.)、棣棠花(Kerriasp.)、鸢尾(Irissp.)、月季(Rosasp.)和女贞(Ligustrumsp.)样品不含TMV。

2.2 RT-PCR结果

使用引物TMV F/R对采集的8种园林植物样品进行PCR检测，在桃树(Amygdalussp.)和海棠(Malussp.)样品中扩增到410 bp的片段，为部分外壳蛋白基因，与预期大小相符(图1)。

注：M是DNA Marker AL2000+；1—8 是大叶黄杨、早熟禾、棣棠花、鸢尾、月季、桃树、海棠和女贞；9是阳性对照；10是阴性对照。Note: M is DNA Marker AL2000+; 1-8 is Buxus sp., Poa sp., Kerria sp., Iris sp., Rosa sp., Amygdalus sp., Malus sp. and Ligustrum sp.; 9 is positive control; 10 is negative control.图1 北京市昌平地区园林植物TMV的RT-PCR检测结果Fig.1 RT-PCR results of TMV in garden plants in Changping district, Beijing

2.3 TMV分离物的序列分析

将含有目的片段的扩增产物进行序列测定，获得中国烟草花叶病毒桃树分离物TMV-Bjts和中国烟草花叶病毒海棠分离物TMV-Bjht。获得的2个TMV分离物的核苷酸序列同源性为98.54%。使用NCBI进行核苷酸序列比对分析，中国烟草花叶病毒桃树分离物TMV-Bjts与中国烟草花叶病毒丁香分离物TMV-S[15](GenBank登录号：AY566702.1)的同源性为99.51%，中国烟草花叶病毒海棠分离物 TMV-Bjht与中国烟草花叶病毒丁香分离物TMV-S (GenBank登录号：AY566702.1)的同源性为99.02%。

分析引用的TMV分离物序列号和来源见表1，基于外壳蛋白基因核苷酸序列的TMV分离株的系统发育树见图2。选取TMV模式种序列、中国地区来自不同寄主的16条TMV分离物序列和该研究获得的2个TMV分离物序列，并以蕃茄花叶病毒(tomato mosaic virus，ToMV)(GenBank 登录号：AF332868.1)作为组外病毒对照，用Maximum Likelihood法构建系统发育树。中国烟草花叶病毒桃树分离物TMV-Bjts和中国烟草花叶病毒海棠分离物TMV-Bjht都与中国烟草花叶病毒丁香分离物TMV-S亲缘关系较近，归属于组2。

表1 分析引用的TMV分离物序列号和来源

图2 基于外壳蛋白基因核苷酸序列的TMV分离株的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of TMV isolates based on the nucleotide sequence of coat protein gene

3 讨 论

烟草花叶病毒危害严重，侵染植物后叶片呈花叶和坏死斑，并且能与其他病毒复合侵染进一步加重植株的症状[16-17]。同时，TMV也能侵染园林植物，影响其观赏价值和绿化效果。该研究采集的8种园林植物中，鸢尾(Irissp.)、月季(Rosasp.)、桃树(Amygdalussp.)和海棠(Malussp.)病毒病的相关研究不多[18-21]，而北京市还没有鸢尾(Irissp.)和海棠(Malussp.)病毒病的相关报道。此外，大叶黄杨(Buxussp.)、棣棠花(Kerriasp.)和女贞(Ligustrumsp.)在中国更鲜有相关病毒病的记录。

目前，RT-PCR方法除能检测病毒外，也能根据核苷酸序列检测分析给相关的病毒分离物划分株系[22]。该研究使用间接ELISA和RT-PCR方法对北京市昌平地区园林植物进行TMV的检测，在桃树和海棠中获得阳性样品。TMV寄主范围虽广，中国未见TMV侵染蔷薇科苹果属海棠的报道，少见TMV侵染蔷薇科桃属的报道[23]。

将TMV不同分离物的CP核苷酸序列与中国报道的TMV分离物序列进行分析比对，中国烟草花叶病毒桃树分离物TMV-Bjts和中国烟草花叶病毒海棠分离物 TMV-Bjht都归属TMV组2。该研究检测的样品种类有限，今后应该扩大检测地区，增加检测样品的数量，进一步明确中国园林植物TMV的发生情况。