萝芙木乙醇提取物舒张小鼠气管平滑肌的作用机理

沈金花，李威

（中南民族大学 生命科学学院& 医学生物研究所& 武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，武汉 430074）

哮喘是一种由结构细胞、炎症细胞、细胞组分等共同参与的疾病［1］.临床研究发现，哮喘的症状通常为阵发的呼吸困难、反复发作的喘息、胸闷以及咳嗽等，且通常伴随有哮鸣音［2］.气管平滑肌的收缩特性在哮喘发作中起重要作用［3］.调查显示，全球患有哮喘的人数现已超过3亿人［4］.哮喘对患者的生活和整个社会都造成了负担，临床上治疗哮喘以缓解症状为主［5］，目前常规的药物并不能彻底治愈哮喘，且长期使用会使患者产生一定耐药性，不利于疾病的治疗.因此，新型药物的开发是临床治疗哮喘亟待解决的一个问题.而中药价格低廉、作用温和、且不易产生耐药性，可以此为切入点寻找出治疗哮喘的有效药物.

萝芙木（Rauvofia verticillata）是取自夹竹桃科植物萝芙木的根部作为中药材，可清热、降压、利尿、安神，对感冒发烧、跌打损伤、咽喉肿痛、头痛、失眠、高血压等病症有治疗效果［6］.目前，国内外对于萝芙木在气管平滑肌方面的作用的研究还处于空白阶段.而本课题组通过预实验发现萝芙木乙醇提取物可以舒张异常收缩的小鼠离体气管环，因此，本文以萝芙木的乙醇提取物为实验药物探究其对小鼠气管平滑肌的舒张作用及作用机理.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 试剂和仪器

萝芙木（采自云南昆明，经中南民族大学生命科学学院刘虹副教授鉴定为萝芙木根部）；乙酰胆碱（上海源叶生物科技）；氯化钾、氯化锂、无水乙醇（国药集团化学试剂）；Pyr3、Gadolinium、硝苯地平（美国Sigma）.

2 Ca2+PSS：135 mmol·L-1NaCl、10 mmol·L-1Glucose、10 mmol·L-1HEPES、5 mmol·L-1KCl、2 mmol·L-1CaCl2、1 mmol·L-1MgCl2·6H2O，用NaOH溶液调节pH 至7.4. 0 Ca2+PSS：135 mmol·L-1NaCl、10 mmol·L-1Glucose、10 mmol·L-1HEPES、5 mmol·L-1KCl、1 mmol·L-1MgCl2·6H2O、0.5 mmol·L-1EGTA，用NaOH 溶液调节pH 至7.4. 2 Ca2+母液：120 mmol·L-1CaCl2. Li-PSS：135 mmol·L-1LiCl、10 mmol·L-1Glucose、10 mmol·L-1HEPES、5 mmol·L-1KCl、2 mmol·L-1CaCl2、1 mmol·L-1MgCl2·6H2O，用Trisbase溶液调节pH至7.4.

DZ-1A真空干燥箱、FW135型中草药粉碎机（天津市秦斯特仪器）；体视显微镜（SZM，武汉爱斯佩科学仪器）；HV-4型离体组织器官恒温灌流系统、BL-420S型生物机能实验系统（成都泰盟科技）；JH-2型张力换能器（中国北京·航天医学工程研究所）；小动物肺功能仪（Flexivent，SCIREQ Inc，Montreal，Canada）.

1.1.2 实验动物

无特定病原体级（SPF级）小鼠，品系为BALB/c，雄性，6～8 周龄，购买于湖北省疾病预防控制中心，在中南民族大学实验动物中心进行饲养.动物实验按照《中南民族大学实验动物使用与福利指导手册》中相关规定进行.

1.2 萝芙木乙醇提取物的制备

取用萝芙木的根部作为原料，将其研磨成粉末状.以体积比例为1∶10 的固液比把萝芙木粉末与95%的乙醇溶液混合，在常温下浸泡4 d 后，经旋转蒸发得到萝芙木乙醇部提取物，充分烘干后去除残留的乙醇，根据溶解度选择二甲基亚砜（DMSO）进行溶解.

1.3 小鼠离体气管环的分离与上样

利用脊椎脱臼法处死小鼠，将气管及肺部组织取下，放置到冰浴后的PSS溶液中，利用体视显微镜去除黏附于气管环上的血块及组织，将主气管两端剪断，分离出约5 mm主气管环.取边长约为5 mm的三角钩固定气管环后，连接到张力换能器上.此时向37 ℃恒温水浴槽中加入6 mL PSS，持续给予氧气供应.将气管环置于水浴槽中，调前负荷数值为270～300 mg，稳定15 min 后重新加入PSS 溶液，调前负荷数值为270～300 mg，共计平衡60 min.平衡结束后利用激动剂刺激气管环，当气管环收缩至稳定水平时，将其洗脱，使其稳定在基线30 min后正式实验.

1.4 呼吸系统阻力的检测

用1%戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉，每20 g 体重注射200 μL.将完全麻醉的小鼠腹部朝上进行固定，用酒精消毒后剪开小鼠气管所在部位的皮肤和肌肉，使气管暴露，将气管剪开一个“T”型小口，插入插管，深度约为2～3个气管环，棉线打结以固定插管，将小鼠通过金属插管连接到肺功能仪的“Y”型管上，保持水平.连接Fexivent 系统，让小鼠进行深呼吸使其达到最佳实验状态.首先测量基线，待基线平稳可靠后向雾化头中按0～50.0 mg·mL-1的浓度梯度加入ACh 或混合了EERV 的ACh，根据实验设计使小鼠雾化吸入上述药物，获得相应的Rrs 值，重复6次进行统计分析.

2 结果与讨论

2.1 EERV对高钾诱导预收缩的气管平滑肌的舒张作用

高钾溶液是电压依赖性钙通道（VDCCs）的一种激动剂，可通过作用于气管平滑肌上的VDCCs 使细胞外的Ca2+出现内流的现象，此时细胞内游离的Ca2+浓度迅速升高进而导致气管平滑肌发生收缩作用［7］.EERV 可剂量依赖性地有效舒张由高钾诱导预收缩的气管环（图1（a）、图1（b）），最大舒张值为（101.88±1.13）%，IC75=0.418 mg·mL-1，IC50=0.194 mg·mL-1.为了达到较显著的效果，选取IC75进行实验.硝苯地平（Nifedipine）对L-型电压依赖性钙通道（VDLCCs）可起阻断作用［8］，在浓度为80 mmol·L-1的高钾溶液作用下预收缩的气管环可被10 μmol·L-1Nifedipine 全部舒张（图1（c））.EERV 对静息的气管环张力不产生影响（图1（d））.实验结果提示：EERV 可通过抑制VDLCCs 达到舒张高钾诱导预收缩的气管平滑肌的作用.

图1 EERV对高钾诱导预收缩的气管环的舒张作用（n=6）Fig.1 Relaxation effect of EERV on the precontracted trachearing induced by high K+（n=6）

2.2 EERV抑制高钾诱导的外钙内流

在0 Ca2+环境下，气管环无法收缩，恢复正常Ca2+水平后，在激动剂高钾的作用下，气管环收缩.0.418 mg·mL-1EERV 可抑制这种收缩（图2（a））.用0.418 mg·mL-1EERV 提前孵育，当Ca2+水平恢复后，高钾仅可小幅收缩气管环（图2（b））.结合2.1 可知，高钾诱导了小鼠气管平滑肌的VDLCCs 的开放，引发细胞外的Ca2+进入细胞内，收缩气管平滑肌，EERV 可阻断VDLCCs 进而抑制Ca2+内流，从而舒张小鼠气管平滑肌.

图2 EERV对高钾诱导的Ca2+内流的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of EERV on Ca2+influx induced by high K+

2.3 EERV 对ACh 诱导预收缩的气管平滑肌的舒张作用

ACh 是多种离子通道的激动剂，可通过打开非选择性阳离子通道（NSCCs）等多种离子通道使细胞中Ca2+浓度升高，导致气管平滑肌达到收缩的状态［9-10］.浓度为100 μmol·L-1的ACh 可使气管环达到最大收缩状态，EERV 可以有效抑制这种收缩，呈现剂量依赖性（图3（a）），最大舒张值为（99.73±1.11）%，IC75=2.039 mg·mL-1，IC50=1.244 mg·mL-1（图3（b））.说明EERV可以舒张ACh诱导预收缩的气管平滑肌.

图3 EERV对ACh诱导预收缩的气管环的舒张作用（n=6）Fig.3 Relaxation effect of EERV on the precontracted trachearing induced by ACh（n=6）

利用100 μmol·L-1浓度的ACh 使离体气管环达到最大收缩状态，Nifedipine可以起到消除VDLCCs影响的作用，此时气管环小幅舒张，加入2.039 mg·mL-1EERV 后，气管环的收缩完全被抑制（图4（a））.当Nifedipine 存在时，ACh 仍然可以刺激气管环达到最大收缩状态，且能被EERV 舒张（图4（b））.结果表明，EERV 还可通过其他离子通道起到舒张ACh 诱导产生预收缩的气管平滑肌的作用.

图4 排除VDLCCs后EERV对ACh诱导预收缩的气管环的舒张作用Fig.4 Relaxation effect of EERV on the precontracted trachea ring induced by ACh without VDLCCs

2.4 EERV抑制ACh引起的内钙释放

0 Ca2+条件下利用ACh 刺激气管平滑肌，Ca2+从肌质网释放，细胞中的Ca2+浓度增加，诱导气管环产生小幅收缩.当Ca2+水平恢复后，细胞外的Ca2+出现内流的现象，导致气管环迅速产生收缩，EERV 可抑制这种收缩（图5（a）），说明EERV 可抑制ACh 引起的外钙内流及内钙释放.为了验证这一结论，提前孵育EERV，在Ca2+水平恢复后，ACh 仅使气管环产生小幅收缩，并很快恢复至基线（图5（b）），证明EERV 可通过抑制外钙内流及内钙释放两种方式舒张ACh 诱导预收缩的气管平滑肌.为了进一步对离子通道进行研究，阻断VDLCCs 后，ACh 仅可小幅收缩气管环，当Ca2+水平恢复后，气管环迅速收缩，这种收缩可被EERV 抑制（图5（c）），因此推测：ACh引起的气管平滑肌的收缩中可能有NSCCs 的参与.为了验证此推测，阻断VDLCCs 后，用EERV 和NSCCs中TRP 的阻断剂Pyr3 以及Gadolinium 作用于气管环［11-12］，ACh 引发的气管环收缩被抑制（图5（d）、图5（e））.以上结果表明，NSCCs 也参与了ACh 引起的气管平滑肌收缩，EERV 可通过阻断NSCCs 抑制ACh引起的内钙释放.

图5 EERV对ACh引起的内钙释放的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of EERV on Ca2+release activated by ACh

2.5 EERV抑制Na+/Ca2+交换

研究表明，NCX（Na+/Ca2+交换体）也可以影响细胞内Ca2+浓度.当气管平滑肌细胞内的Ca2+浓度上升或者Na+浓度下降时，细胞内Ca2+排出；反之则导致Ca2+泵入细胞［13］.当浴液为含有Na+的PSS 溶液时，ACh 可诱导气管环达到最大收缩，这种收缩可被EERV 抑制（图6（a））.当气管环处于不含Na+的Li-PSS 溶液时，细胞内Ca2+浓度上升，气管环基础张力上升，加入ACh 后，离体气管环产生一定收缩，EERV 可使气管环张力降至基线之下（图6（b））.两组气管环基础张力值具有显著性差异，P＜0.01；两组气管环收缩值具有极显著性差异，P＜0.001（图6（c））.以上结果表明：NCX 也参与了气管平滑肌收缩，EERV 可通过抑制Na+/Ca2+交换来舒张ACh诱导预收缩的气管平滑肌.

图6 EERV对Na+/Ca2+交换的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of EERV on Na+/Ca2+exchange

2.6 EERV对组织活性的影响

用EERV 使在高钾或ACh 刺激下收缩的气管环舒张后，洗脱3 次，再次加入相同的激动剂刺激后，气管环均可再次收缩，但无法达到最大收缩值（图7（a）、图7（c））.用ACh 再次刺激该气管环，其收缩值为（78.81±3.28）%，用高钾再次刺激该气管环后，其收缩值为（64.76±1.34）%（图7（b）、图7（d））.上述实验结果说明：EERV 可舒张预收缩的气管平滑肌，其洗脱后无法恢复可能由于药物无法完全被瞬时洗脱.

图7 EERV对组织活性的影响Fig.7 Effect of EERV on tissue activity

2.7 EERV降低ACh引起的Rrs

当哮喘病情发展到一定程度，出现不可逆的气道功能改变时，患者肺功能明显异常，利用肺功能仪对小鼠Rrs进行检测，可反映哮喘的严重程度.按0～50.0 mg·mL-1浓度梯度加入ACh（对照组）模拟哮喘发生时的状态，发现Rrs 随ACh 浓度增加而升高.在ACh中加入37.3 mg·mL-1EERV（实验组）后，可显著降低Rrs.当ACh 浓度为12.5 mg·mL-1时，对照组和实验组Rrs 值具有差异性，P＜0.05；当ACh 浓度为25.0、50.0 mg·mL-1时，对照组和实验组Rrs值均具有极显著性差异，P＜0.001（图8）.

图8 EERV对小鼠呼吸系统阻力的影响Fig.8 Effect of EERV on mouse respiratory system resistance

3 结语

哮喘属于异质性和基因性的复合型疾病［14］.目前的药物均无法彻底根治哮喘，且存在一定副作用.研究表明萝芙木中含有大量的单萜吲哚生物碱及其他类型生物碱和非生物碱，药理活性主要为降血压、抗肿瘤、抗炎、镇静等，其在民间主要以根部入药［15］.目前的研究主要是针对萝芙木中所含的生物碱所进行的，但尚未发现有对其乙醇提取物的活性成分及药理作用的研究.本课题组前期通过对多种中药提取物的筛选，发现EERV 有潜在的治疗哮喘的作用，故本文对EERV 舒张气管平滑肌的作用机理进行了研究，以期其能够用于治疗或缓解哮喘症状.

哮喘发病机理的重要特征之一是气道高反应性（AHR）.AHR 指多种刺激因子使气道产生过早或过强的收缩反应，而AHR 与气管平滑肌收缩增强有着紧密的联系，因此，与AHR 相关的气管平滑肌细胞收缩信号的变化对哮喘的发展尤为重要［16］.在静息状态下，气管平滑肌细胞中维持相对较低的Ca2+浓度，收缩性激动剂刺激气管平滑肌细胞引起细胞钙库中的Ca2+释放或细胞外的Ca2+流入，细胞中游离状态下的Ca2+浓度增高，最终可收缩气管平滑肌［17］.高钾和ACh可通过影响VDCCs、NSCCs、NCX等离子通道起到调节细胞内Ca2+浓度的作用.利用高钾和ACh模拟哮喘发生时气管平滑肌的状态，经EERV 作用于气管环后，气管平滑肌完全舒张.EERV 抑制细胞外Ca2+通过VDLCCs 进入细胞内，舒张气管平滑肌.另外，阻断VDLCCs 后，EERV 可通过影响NSCCs 和NCX 通道从而抑制ACh引起的细胞外Ca2+向细胞内流入和Ca2+从肌质网向细胞质释放，从而对气管平滑肌起到舒张作用.哮喘是一种呼吸系统疾病，在活体水平上利用肺功能仪对小鼠Rrs进行检测，用ACh刺激小鼠模拟哮喘症状，Rrs随ACh浓度的增加而升高，而在EERV的作用下，上述Rrs被显著抑制，表明EERV可能在活体水平缓解哮喘症状.

综上所述，EERV 可通过影响VDCCs、NSCCs 和NCX 等离子通道，对气管平滑肌起舒张作用，并在活体水平进一步得到了验证.本文实验结果提示：EERV 有望成为治疗或缓解哮喘症状的新药，但还需进行后续更加深入的研究.本文仅从组织水平和活体水平对EERV 舒张气管平滑肌的机理进行了研究，还可以从细胞水平上进一步验证EERV 对离子通道的影响，或者对其主要起舒张气管平滑肌作用的有效成分进行进一步研究.由于哮喘是一种炎症性疾病，还可通过研究EERV 对炎症因子表达的影响，进一步检验EERV对哮喘病情缓解的效果.