贮藏温度对采后龙眼果实糖代谢及其相关酶活性的影响

关博洋，殷菲胧，刘云芬，廖玲燕，陈振林，帅 良,

（1.大连工业大学食品学院，辽宁大连 116034；2.贺州学院食品与生物工程学院/食品科学与工程技术研究院，广西贺州 542899）

龙眼（Dimocarpus longanLour.）是我国南方主要亚热带水果之一，属于无患子科龙眼属植物，果实营养丰富，具有较高的药用价值和保健作用，一直以来都被作为珍贵补品，有着“南方小人参”之称[1]。我国是全世界最主要的龙眼生产国，四川、福建、广东、广西是我国的主产区，海南、云南、贵州、重庆、台湾也有栽培，浙江仅零星分布。据统计，2016年我国龙眼种植面积达37.6万hm2，占世界比例54.8%，产量为191.4万吨，占世界比例54.7%；龙眼面积为1978年的17.9倍[2]。

龙眼果实的糖含量和种类很大程度上影响了果实品质、甜度及风味，而糖分积累和糖代谢离不开蔗糖代谢相关酶的调控。果实的糖代谢主要受蔗糖磷酸合成酶（sucrosephosphate synthase）、蔗糖合成酶（sucrose synthase）、酸性转化酶（acid invertase）和中性转化酶（neutral invertase）的调控和影响[3−4]。目前，研究者已针对水果糖组分及糖代谢方面开展了较多研究，但多侧重于对于不同资源类型果实中糖酸组分的分析[5−8]。龙眼作为我国南方主要的经济栽培果树，其果实糖代谢方面研究较少。赵云峰等[9]研究采后‘福眼’龙眼果实于不同贮藏温度条件下的贮藏品质发现，与常温贮藏对比，在低温环境贮藏可保持采后龙眼果实较高的营养物质含量，同时具有较好的保鲜效果；马凤凰[10]对福建省3个栽培品种“福眼”、“东壁”、“乌龙岭”果实中糖分和蔗糖代谢酶活性进行研究发现，不同品种在不同发育期所含的糖分和蔗糖代谢相关酶活性变化存在差异；陈锦等[11]以“松风本”龙眼果实为材料，研究了贮藏温度对龙眼果实品质的影响，结果表明低温贮藏能够有效的延缓龙眼果实采后呼吸强度，保持较高的可溶性固形物、蔗糖、还原糖等含量。前人虽对不同温度贮藏的龙眼有研究，但仅限于龙眼果实采后生理、品质特性等方面，而糖代谢相关方面的研究却鲜有报道。‘石硖’龙眼是广东与海南地区主栽品种，‘石硖’龙眼相比于其他龙眼品种具有核小、肉厚且味道清甜肉质爽脆的特点，作为最好的龙眼品种，深受人们的喜爱和欢迎。‘石硖’龙眼成熟期于7月中下旬至8月上旬，因天气炎热, 果实采收期短、成熟快且采摘后极易退糖[12]，主要表现在甜度下降、品质变差，造成不必要的经济损失。

因此，本文以‘石硖’龙眼为材料，研究其果肉在不同温度贮藏过程中糖组分及相关酶活性的变化，探明两者之间的关系，为进一步研究龙眼果实品质和保鲜贮藏提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验材料‘石硖’龙眼 采购于贺州市八步区农贸市场。

蔗糖、果糖和葡萄糖 色谱纯（纯度≥99%），上海源叶生物科技有限公司；氯化镁（MgCl2） 天津市大茂化学试剂厂；羟乙基哌嗪乙硫磺酸（Hepes） 上海源叶生物科技有限公司；氢氧化钠（NaOH） 西陇科学股份有限公司；二硫苏糖醇（DTT）、牛血清白蛋白（BSA）、Triton-100 北京索莱宝科技有限公司；甘油 天津市致远化学试剂有限公司；乙二胺四乙酸（EDTA） 广东广试试剂科技有限公司；以上试剂均为分析纯。

LH-B55手持折光仪 上海勃基仪器仪表有限公司；FA2004B电子天平 上海精科天美科学仪器有限公司；HWS-12电热恒温水浴锅 上海一恒科仪器有限公司；UV-1600PC紫外可见分光光度计 上海美普达仪器有限公司；TG18-WS台式高速冷冻离心机 长沙湘锐离心机有限公司；702-Rell超低温冰箱（−80 ℃） 美国Thermo Forma公司；IM-F124制冰机 日本San Yo公司；智能人工气候箱 宁波江南仪器厂；LC-2030C 3D高效液相色谱仪 岛津企业管理（中国）有限公司；Water Sep-Pak C18Cartridges、6 mm×300 mm Waters SugarPak1糖 柱 美 国Waters Corporation。

1.2 实验方法

1.2.1 原料处理 挑选形状正常、无病虫害、无机械伤的果实清洗干净后捞出后晾干，用PE保鲜膜及塑料托盘进行包装，每个托盘装8个，分别贮藏在4、15和25 ℃的智能人工气候箱中。4 ℃每8 d取样1次，15 ℃每4 d取样1次，25 ℃每2 d取样1次[11,13]，分别测定可溶性固形物（SSC）含量，剩余样品液氮冷冻存于−80 ℃超低温冰箱用于测定葡萄糖、蔗糖、果糖含量及酸性转化酶（AI）、中性转化酶（NI）、蔗糖合成酶（SS）指标。

1.2.2 指标测定

1.2.2.1 可溶性固形物（SSC）含量的测定 随机取15个龙眼使用手持式折光仪测定龙眼果汁中SSC含量，含量用%表示。

1.2.2.2 可溶性糖含量的测定 可溶性糖含量的测定参照帅良等[14]的方法并略有改动，称取1 g龙眼果肉于研钵中，微波杀酶30 s，加入2 mL超纯水研磨成匀浆，转入50 mL带刻度离心管，重复清洗研钵3~4次，定容至50 mL，混匀后取2 mL溶液于EP管中4 ℃下12000 r/min条件下离心15 min，取上清液过Water Sep-Pak C18Cartridges脱色柱后待测。糖含量采用高效液相色谱仪测定，色谱条件为: Waters SugarPak1糖柱，柱温80 ℃，流动相为超纯水，流速为0.6 mL/min，以果糖、蔗糖、葡萄糖为标品根据峰面积绘制标曲计算样品中可溶性糖含量（葡萄糖标曲：y=0.00000352x+0.00097085，R2=0.99996400；蔗糖标曲：y=0.00000370x−0.00669662，R2=0.99996977；果糖标曲：y=0.00000368x−0.00222312，R2=0.99991427），可溶性糖含量结果以mg·g−1表示。

1.2.3 龙眼果实酶的提取 转化酶的提取参照AKIRA等[15]和HUBBARD等[16]的方法，并稍有修改。将龙眼果实于液氮速冻后，用研磨机将其研磨成粉末，称取1 g龙眼果实粉末，加入1.5 mL的预冷50 mmol/L pH7.5 Hepes-NaOH提取缓冲液（内含5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EDTA，2.5 mmol/L DTT，0.05% Triton-100（v/v），0.5 mg/mL BSA，10% 甘油（v/v）），4 ℃下13000 r/min离心15 min，取1 mL上清液于PD-10（SephadexTM G-25M，GE Health-care）脱盐柱中脱盐，先用1.8 mL的平衡液（25 mmol/L Hepes-KOH（pH为7.5），5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EDTA，30% 甘油（v/v））冲洗，此次冲洗液不收集，再用2 mL平衡液冲洗，并用2 mL冻存管收集冲洗液作为酶提取液，于4 ℃待用。每个样品重复3次。

1.2.4 龙眼果实酸性转化酶（AI）测定 酸性转化酶活性测定参考LOWELL等[17]的方法，略作修改，取0.3 mL酶液加入0.7 mL反应液（1%蔗糖，100 mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH4.5）），于37 ℃水浴3 h后沸水浴5 min终止反应，以0.3 mL煮沸酶液加入0.7 mL反应液作对照。以DNS法测定葡萄糖生产量，酶活以mg·h−1·g−1为单位。

1.2.5 龙眼果实中性转化酶（NI）测定 中性转化酶活性的测定参考LOWELL等[17]的方法，方法与AI相同，但反应液为100 mmol/L pH7.5 Hepes-NaOH（内含1%蔗糖，5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EDTA）。

1.2.6 龙眼果实蔗糖合成酶（SS）测定 蔗糖合成酶活性的测定参考LOWELL等[17]的方法，略作修改，取0.1 mL酶液加入0.1 mL反应液（80 mmol/L Mes缓冲液（pH5.5），5 mmol/L NaF，100 mmol/L 蔗糖，5 mmol/L UDP），于37 ℃水浴3 h后沸水浴5 min终止反应，以DNS法测定葡萄糖生产量，酶活以mg·h−1·g−1为单位。

1.3 数据处理

采用Excel软件处理实验数据，采用SPSS 19.0软件对数据进行单因素方差分析（Duncan法，显著水平（P<0.05）和因子分析，采用OriginPro 8.0软件对各相关指标作图。

2 结果与分析

2.1 龙眼可溶性固形物（SSC）含量的变化

由图1可知，‘石硖’龙眼采后的可溶性固形物质量分数为23.5%，在整个贮藏期内，龙眼果肉在3个贮藏温度下的可溶性固形物含量均呈下降的趋势。4 ℃处理组SSC含量0 d时含量最高为23.5%，贮藏32 d后下降为22.4%，总体下降1.1%，且可溶性固形物含量始终高于其他两个处理组的龙眼；而15 ℃处理组SSC含量始终高于25 ℃处理组，15 ℃处理组SSC含量在0 d时含量最高为23.5%，贮藏16 d后下降为22.3%，下降了1.2%；25 ℃处理组SSC含量在0 d时含量最高为23.5%，贮藏8 d后下降为22.0%，下降了1.5%。4 ℃和15℃处理组龙眼贮藏到最后可溶性固形物含量仍然保持在22%以上。果实中的可溶性固形物含量及种类对果实的风味品质有着决定性的影响。可溶性固形物中糖类物质是其重要的组成部分，可作为能源物质，使果实进行正常的生理代谢活动[18]。低温贮藏可以抑制果实可溶性固形物含量的下降，并延缓果实衰老，使贮藏期延长[19−21]，这与本实验中4 ℃处理组可溶性固形物含量始终高于其他两个贮藏温度的龙眼的贮藏效果一致，更进一步证明了低温贮藏可延缓龙眼果实中可溶性固形物的分解。

图1 龙眼果实贮藏过程中SSC的变化Fig.1 Changes of SSC in longan fruits during storage

2.2 不同贮藏温度对龙眼果实葡萄糖含量的影响

果实内累积的可溶性糖包括果糖、蔗糖和葡萄糖，在果实品质成分和风味物质合成中具有重要作用。葡萄糖与果糖互为同分异构体，是果实中重要的供能物质，也是细胞代谢的中间产物[22]。由图2可知，不同贮藏温度下龙眼的葡萄糖含量变化趋势有差别。总体看来25 ℃处理组龙眼葡萄糖含量呈上升趋势，在贮藏2~4 d葡萄糖含量急剧上升，由44.2 mg·g−1·FW上升到49.3 mg·g−1·FW，含量上升了11.5%，6 d后缓慢下降；4 ℃和15 ℃处理组葡萄糖含量总体呈下降趋势，15 ℃处理组葡萄糖含量由0 d的44.1 mg·g−1·FW下降到贮藏末期的32.2 mg·g−1·FW，含量下降了27.0%；4 ℃处理组葡萄糖含量由0 d的44.1 mg·g−1·FW下降到贮藏末期的29.9 mg·g−1·FW，下降了32.2%。低温贮藏抑制了龙眼果实蔗糖降解酶AI、NI、SS活性的增加，使蔗糖被降解的更为缓慢，因此抑制了葡萄糖的产生。这与香蕉[23]研究结果较为一致。

图2 龙眼果实贮藏过程中葡萄糖含量的变化Fig.2 Changes of flucose content in longan fruits during storage

2.3 不同贮藏温度对龙眼果实果糖含量的影响

由图3可知，不同贮藏温度下龙眼的果糖含量变化趋势有差别。总体看来，25 ℃处理组果糖含量呈缓慢上升的趋势，由最初的37.6 mg·g−1·FW上升到45.0 mg·g−1·FW，含量上升了19.7%；4 ℃和15 ℃处理组果糖含量总体呈下降趋势，且4 ℃处理组果糖含量始终低于15 ℃处理组。15 ℃处理组果糖含量由0 d的37.6 mg·g−1·FW最终下降到29.5 mg·g−1·FW，含量下降了21.5%；4 ℃处理组果糖含量由0 d的37.6 mg·g−1·FW下降到贮藏末期的16.5 mg·g−1·FW，含量下降了56.1%。说明低温贮藏下能有效抑制果糖组分的产生。这与脐橙[24]研究结果较为一致。这可能与低温抑制了AI、NI、SS的活性有关。

图3 龙眼果实贮藏过程中果糖含量的变化Fig.3 Changes of fructose content in longan fruits during storage

2.4 不同贮藏温度对龙眼果实蔗糖含量的影响

由图4可知，贮藏过程中3个不同贮藏温度龙眼的蔗糖含量逐渐下降且蔗糖含量各不相同，其中4 ℃处理组蔗糖含量始终是3个处理组中最高的，蔗糖含量由0 d的117.4 mg·g−1·FW下降到95.0 mg·g−1·FW，蔗糖含量仅下降了19.1%；15 ℃处理组蔗糖含量由117.4 mg·g−1·FW下降到77.9 mg·g−1·FW，含量下降了33.6%；25 ℃处理组蔗糖含量由117.4 mg·g−1·FW下降到92.8 mg·g−1·FW，含量下降了21%。因3个处理组贮藏天数不同，25 ℃处理组的龙眼贮藏时间为8 d，而在第8 d蔗糖含量15 ℃处理组是高于25 ℃处理组的，因此，3个处理组龙眼果肉退蔗糖能力依次为25 ℃>15 ℃>4 ℃。糖含量参与植物细胞的能量代谢[25]，蔗糖是由葡萄糖及果糖组成的双糖物质，在果实发育后期逐渐积累，是果实品质的重要影响因素。帅良[26]以石硖和储良两个龙眼品种为实验材料，研究了龙眼果实糖代谢发现，成熟果实在常温贮藏的过程中蔗糖含量下降，这与本实验研究结果一致。3个温度处理组蔗糖含量都有所下降，这与糖分被当作呼吸基质消耗，蔗糖转化为还原糖有一定的关系，但4 ℃处理组的蔗糖含量明显比其余两组下降速度慢，说明低温可以有效延缓蔗糖的下降，这可能与低温抑制果实的呼吸作用及糖分的转化速率降低有关。

图4 龙眼果实贮藏过程中蔗糖含量的变化Fig.4 Changes of sucrose content in longan fruits during storage

2.5 不同贮藏温度对龙眼果实AI活性的影响

如图5可知，不同贮藏温度AI活性在贮藏过程中的变化趋势都为逐渐上升且酶活性与蔗糖含量呈现相反趋势，25 ℃处理组在贮藏0~4 d时AI活性缓慢上升，在4~8 d时急剧上升后趋于平稳，且25 ℃处理组的AI活性始终高于其他两组，第8 d AI酶活

图5 龙眼果实贮藏过程中AI活性的变化Fig.5 Changes of AI activity in longan fruits during storage

性达到最高，为65.4 mg·h−1·g−1FW；15 ℃处理组在0~8 d时缓慢上升，在8 d后急剧上升，并在贮藏16 d时酶活性达到最高，为55.0 mg·h−1·g−1FW；4 ℃处理组AI活性虽然呈现逐渐上升的趋势，但是变化幅度较平缓，而且相比于其他两个处理组，龙眼AI活性始终维持在较低水平，贮藏至32 d时酶活性仅为21.84 mg·h−1·g−1FW，说明低温可以延缓AI活性的上升。植物体内酸性转化酶的主要作用是在酸性条件下使蔗糖水解为葡萄糖及果糖，此反应为不可逆。张强等[27]研究了糖代谢与甜瓜果实后熟软化的关系，结果表明低温贮藏能够更为有效地抑制甜瓜果实的呼吸代谢，并降低糖代谢酶活性，这与本实验研究结果一致。

2.6 不同贮藏温度对龙眼果实NI活性的影响

中性转化酶（NI）在参与植株的正常生长中发挥着重要作用[28]，其主要作用是在中性环境下将蔗糖降解为葡萄糖和果糖，由图6可知，不同贮藏温度龙眼NI活性在贮藏过程中的总体变化趋势为上升趋势，这与蔗糖含量逐渐下降相一致。25 ℃处理组在贮藏0~6 d时AI活性缓慢上升，在6~8 d时急剧上升，在贮藏末期NI酶活性达到最高为72.1 mg·h−1·g−1FW；其次，NI活性较高的为15 ℃处理组，在0~12 d时缓慢上升，在8 d后急剧上升，在贮藏末期酶活性达到51.6 mg·h−1·g−1FW；4 ℃组NI活性虽总体呈上升趋势，与其他处理组相比NI活性始终维持在较低水平。贮藏至32 d时酶活性仅为23.7 mg·h−1·g−1FW。因此，低温组相较于其余两个处理组很大程度上延缓了NI活性的增加，这一结果与香蕉类似[29]。

图6 龙眼果实贮藏过程中NI活性的变化Fig.6 Changes of NI activity in longan fruits during storage

2.7 不同贮藏温度对龙眼果实SS活性的影响

贮藏温度对果实糖代谢会产生一定影响[30]。蔗糖合成酶（SS）能够将蔗糖分解为果糖和尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG），且此反应是可逆的，但多数情况下SS的主要作用是分解蔗糖，为多糖的合成提供前体[31]。由图7可知，不同贮藏温度SS活性在贮藏过程中的变化趋势均为上升趋势，这与蔗糖含量逐渐下降一致。25 ℃处理组酶活性由0 d的20.944 mg·h−1·g−1FW上升到94.744 mg·h−1·g−1FW；其次，SS活性较高的为15 ℃处理组，由20.944 mg·h−1·g−1FW上升到68.344 mg·h−1·g−1FW；4 ℃组SS活性总体呈现上升趋势，但是变化幅度较为缓慢，且相较于其他处理组SS活性始终维持在较低水平，贮藏至32 d时酶活性仅为44.0 mg·h−1·g−1FW。说明低温贮藏延缓了龙眼果实SS活性的上升，这一结果与芒果[32]研究结果一致。

图7 龙眼果实贮藏过程中SS活性的变化Fig.7 Changes of SS activity in longan fruits during storage

2.8 糖代谢相关指标的主成分分析

对龙眼贮藏过程中糖组分以及糖代谢相关酶等指标标准化处理之后进行主成分分析，第1和第2主成分特征值分别为3.379和2.171，第1和2主成分贡献率分别为56.316%和36.185%，前2个主成分特征值均大于1且累积贡献率达到92.501%，可见前2个主成分可以说明龙眼贮藏期间生理指标有关数据的变化趋势，完全符合主成分分析的基本要求，因此取前2个主成分进行数据分析。用2个变量FAC1-1、FAC2-1代替原来的6个指标，得出线性组合为：

由因子载荷图8可知，葡萄糖含量、果糖含量、AI、NI、SS聚集在PC1（56.316%）正轴上，蔗糖含量聚集在PC1（56.316%）负轴上，表明PC1（56.316%）越大，葡萄糖含量、果糖含量、AI、NI、SS活性越高，故定义PC1为糖代谢相关酶指标；同时蔗糖含量、果糖含量、葡萄糖含量聚集在PC2（36.185%）正轴上，表明PC2（36.185%）越高，蔗糖含量、果糖含量、葡萄糖含量越高，故定义PC2为可溶性糖含量指标。

图8 不同贮藏温度糖代谢相关指标主成分分析因子载荷图Fig.8 Principal component analysis factor loading diagram of related indexes of glucose metabolism at different storage temperatures

由因子得分图9可知，随着龙眼贮藏时间的增加，25 ℃组与PC1轴呈从左到右平行分布，15 ℃组与PC1轴呈四十五度角分布，4 ℃处理组与PC2轴呈平行分布。结合因子载荷图可知，这个过程说明常温下贮藏的龙眼随着贮藏时间的延长，糖代谢相关酶活性越来越高，蔗糖含量逐渐减少，单糖含量在上升；15 ℃处理组较常温组糖代谢相关酶活性低，且蔗糖含量下降速度较常温组下降慢；4 ℃处理组可以看出酶活变化很小。由此说明低温贮藏可以使龙眼的蔗糖代谢平稳且缓慢地进行，可以有效延长龙眼贮藏时间。

图9 不同贮藏温度各时期龙眼果肉样品的主成分分析因子得分图Fig.9 Principal component analysis factor score diagram of related indexes of glucose metabolism at different storage temperatures

2.9 糖代谢相关指标的相关性分析

对不同贮藏温度的龙眼SSC含量、蔗糖含量、葡萄糖含量、果糖含量、AI活性、NI活性、SS活性进行相关性分析（表1）。结果表明，SSC含量与蔗糖含量呈极显著正相关（P<0.01），相关系数为0.804，SSC含量与AI、NI、SS呈极显著负相关（P<0.01），相关系数为−0.801、−0.717、−0.767，由此表明龙眼果实SSC含量的高低一定程度上能够直接反映出其蔗糖含量的高低；蔗糖含量与葡萄糖含量呈显著正相关（P<0.05），相关系数为0.559，与AI、NI、SS呈显著负相关（P<0.05），相关系数为−0.727、−0.596和−0.580，由此可知龙眼在不同贮藏温度下，蔗糖、葡萄糖下降过程相互间有相关性；葡萄糖含量和果糖含量呈极显著正相关（P<0.01），相关系数为0.826，这与它们都由蔗糖降解而来有关；果糖含量与NI活性及SS活性呈显著正相关（P<0.05）；AI和SS活性以及NI活性也呈现极显著正相关（P<0.01）。

表1 不同温度贮藏过程中各指标相关性分析Table 1 Correlation analysis of indexes in different varieties of longan during storage

3 结论与讨论

龙眼属于非呼吸跃变型果实，温度对龙眼果实采后生理及保鲜效果有重要影响，采后龙眼果实适合低温贮藏[33]。高浩祥等[34]的研究表明低温贮藏等采后处理，均可以有效保持采后龙眼果实贮藏品质。孔祥佳等[35]研究了‘立冬本’龙眼果实在采后温度下的呼吸强度，细胞膜透性等方面的变化，结果表明3~4 ℃低温贮藏可以明显降低采后龙眼果实的呼吸强度，保持较高的龙眼果肉SSC、蔗糖等营养物质含量，抑制采后龙眼果肉自溶及果皮褐变，提高龙眼果实商品率。本研究结果表明，常温（25 ℃）及15 ℃贮藏条件下，SSC和蔗糖含量迅速下降，低温有效延缓了龙眼果实SSC和蔗糖含量的下降，不同贮藏温度下龙眼果实的糖组分存在一定差异，同时抑制了蔗糖、葡萄糖、果糖含量的升高，这与低温抑制果实的呼吸作用及减少蔗糖的转化有关。低温贮藏有效抑制了龙眼蔗糖代谢相关酶AI、NI、SS的活性上升。相关性分析表明了SSC含量与蔗糖含量呈极显著正相关，与AI、NI、SS活性呈极显著负相关，说明龙眼果实SSC含量一定程度上能够直接反应出蔗糖含量的高低，不同贮藏温度龙眼果实蔗糖、葡萄糖下降过程相互间有相关性，这与葡萄糖是由蔗糖降解而来有关；AI与NI、SS活性成极显著正相关，推测三种蔗糖代谢相关酶在采后龙眼贮藏过程中发挥着重要的作用。

综上所述，低温可明显抑制龙眼果实糖代谢及相关酶活性的升高，延缓了蔗糖的分解和延长了贮藏时间，其中，4 ℃贮藏效果最佳。本文揭示了温度对采后龙眼糖代谢的影响，而温度影响龙眼果实糖代谢的具体原因，也是今后的研究方向，为今后龙眼糖代谢的进一步研究奠定了基础。