腰果过敏蛋白Ana o 2与Ana o 3结构分析及致敏性预测

张爱琳，赵慧娟，迟 越，梁筱妍，李晓丹，郭 梅

（天津农学院食品科学与生物工程学院，天津 300384）

腰果（Anacardium occidentaleLinnaeus）也称为长寿果与树花生，是漆树科、腰果属的一种常绿乔木[1]。腰果丰富的营养价值与医药价值使得其备受大众喜爱[2−3]。但腰果蛋白是八大食物过敏原之一[4−6]。据研究报道，在我国一些地区，腰果可占食入性过敏原的8.50%，是引起支气管哮喘最重要的食入性过敏原[7−8]。Sicherer等[9]研究发现118名过敏患者中有6%的人对腰果过敏，在后续跟踪调查中发现145名对坚果过敏的人群中有25%对腰果过敏[10−13]。国内有研究学者应用回顾性方法对213名对花生和坚果过敏儿童进行为期42个月的调查，花生过敏率为30.5%，腰果过敏率为74.1%[14]。目前由于缺乏对食物过敏的具体治疗方法，避免食用过敏食物仍然是最好的选择[15−18]。通过对照腰果过敏原的研究报道发现：腰果主要的过敏原为：Ana o 1、Ana o 2、Ana o 3，它们分别是7S豌豆蛋白、11S球蛋白和2S白蛋白，均为种子储存蛋白，但是Ana o 2分子量理论值有差异，有报道53 kD，也有33 kD[19−20]，分析原因有可能腰果过敏蛋白在加工过程中极易分解、聚集，有可能被水解成n端小亚基和c端大亚基或者是由二硫键连接变性还原，包含6、8和10 kDa的三种亚型[21]，所以有必要进一步研究腰果主要过敏蛋白，更好地探究腰果过敏蛋白的表位结构和开发低敏性产品做准备[22]。随着高精度质谱技术飞速发展，通过生物质谱技术分析蛋白质、鉴定肽段已经逐渐成为蛋白质组学的核心技术[23−26]，结合生物信息学数据库搜索预测过敏蛋白的过敏位点是生命科学领域的一个重要研究方向，闫娟娟等[20]成功地克隆了Ana o 3的基因，朱倩倩等[27]通过生物信息软件预测了重组腰果过敏蛋白Ana o 2的结构，但从腰果中分离纯化天然Ana o 2与Ana o 3及对其二级结构的分析还有待完善。Ana o 1在腰果中含量低，过敏性弱，不易分离获得[28]。本研究采用生物信息软件与传统实验方法相结合对致敏性强的腰果主要过敏原Ana o 2与Ana o 3结构进行分析，以便于为后期深入研究腰果过敏机理及过敏蛋白Ana o 1提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

生腰果仁 产于越南，购于淘宝，品牌悠米；石油醚 分析纯，天津津东天正精细化学试剂厂；丙酮

分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司；碳酸氢钠 分析纯，天津市江天化工技术有限公司；考马斯亮蓝G-250 上海蓝季科技发展有限公司；双色预染蛋白Marker 10~250 kD、5×上样缓冲液 上海雅酶生物科技有限公司；葡聚糖凝胶G-150、羊抗人IgG-HRP、BCA蛋白定量检测试剂盒 索莱宝有限公司；硝酸纤维素膜（CN140）、样品垫、结合垫、吸水垫 上海捷宁生物科技有限公司。

H2050R多功能台式冷冻离心机 上海埃德思生物科技有限公司；YA1073透析袋（8000~14000 D）索莱宝有限公司；BT-100纯化仪、CBS-B程控多功能全自动部分收集器 上海沪西分析仪器厂有限公司；752N紫外分光光度计 上海精科仪器厂；PowerPac Basic电泳仪、GelDocXR+凝胶成像仪美国Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 腰果过敏蛋白分离纯化

1.2.1.1 样品破碎与脱脂处理 取适量腰果去皮后于液氮中研碎成粉末，称取适量于烧杯中，分别加入5倍体积的石油醚或丙酮于4 ℃下交替脱脂，直到上清液澄清为止。弃去有机相层，将沉淀置于通风橱中，使有机溶剂挥发干净，称重计算脱脂率。

1.2.1.2 腰果蛋白粗提取液的制备 参考文献资料[29]，将脱脂后的腰果粉以1:10 （w/v）的比例加入pH7.0磷酸盐缓冲液（1 mol/L），在4 ℃下磁力搅拌2 h，随后4 ℃下10000 r/min离心10 min，过滤取上清液，将样品冷冻备用。

1.2.1.3 透析 将粗蛋白提取液灌装在透析袋中置于pH7.0的PBS缓冲液内4 ℃下透析，期间2~4、6~8、10~14 h更换PBS缓冲液，直至缓冲液中不出现絮状沉淀，收集透析液于−80 ℃冰箱保存备用。

1.2.1.4 蛋白的纯化 将葡聚糖凝胶 Sephadex G-150干粉浸泡于蒸馏水中24 h后，煮沸12 h直到完全溶胀，在湿态下一次性灌装到普通亲和层析柱内（操作方法参考说明书）。上样前用pH7.0 PBS缓冲溶液平衡层析柱5个柱体积。样品上样，设置压力为0.4 ba，过0.45 μm水膜，洗脱液为pH7.0、0.01 mol/L的PBS（含0.15 NaCl）在0.2 mL/min流速进行洗脱，等体积收集，每管1 mL。将收集的蛋白含量高的溶液合并备用。

1.2.2 腰果过敏蛋白鉴定及过敏原性验证

1.2.2.1 BCA测定 蛋白浓度采用BCA蛋白定量试剂盒中微孔酶标法测定蛋白浓度，具体操作方法参考说明书。

1.2.2.2 聚丙烯酰胺SDS-PAGE电泳 参照文献[30]，选用Omni_PAGETM预制胶4%~15%。将蛋白样品与5×上样缓冲液进行4:1混合均匀，加热处理5 min，室温冷却。每孔加10 μL样品，最大上样量为60 μL，设置电压150 V，电泳时间40~50 min，当溴酚蓝指示带至胶板底部时结束电泳，取出凝胶，在摇床上染色30 min，倒掉染色液，后进行脱色。待完全褪色后用凝胶成像仪拍照保存。

1.2.2.3 免疫印迹（Western-Blotting） 腰果过敏患者及阴性血清由山西省某人民医院提供。纳入标准:具有荨麻疹、皮炎、哮喘或胃肠道不适等典型的临床过敏症的18~59岁的人群（不分性别），具体操作方法参考文献[31]。一抗：过敏阳性血清，稀释倍数1:100；二抗：羊抗人IgG-HRP，稀释倍数1:5000；SDS-PAGE电泳胶：浓度15%。

1.2.3 腰果过敏蛋白结构测定

1.2.3.1 腰果过敏蛋白质谱测序分析 用甲醇润湿2张聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，然后在小型转移装置中组装转印夹层，夹层顺序为：塑料框、海绵、滤纸、凝胶、2张PVDF膜、滤纸、海绵、塑料框，夹好放到PBS缓冲溶液中，将电压设置为6 V/cm，转移时间因目标蛋白和凝胶的浓度而异；0.1%考马斯亮蓝的50%甲醇染色5 min后用含10%乙酸的50%甲醇脱色，参考1.2.2.2的实验结果对目的蛋白进行切胶（每次切胶都使用新的刀片）；全酶解：加入2 mol/L尿素（Urea） 20 μL酶解30 min；10 mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）（25 mmol/L NH4HCO3溶解）20 μL，37 ℃水浴1 h；加55 mmol/L吲哚乙酸（IAA）（25 mmol/L NH4HCO3溶解）20 μL，置于暗室30 min；加入0.2 μg胰蛋白酶（200 U/mgP），混匀，37 ℃过夜；离心真空冻干，C18ziptip除盐柱除盐，离心真空冻干，−20 ℃保存。将冻干肽段用20 μL 2%甲醇、0.1%甲酸复溶。1200 r/min离心10 min，吸取上清上样。上样体积10 μL，采取夹心法上样。Loading Pump流速350 nL/min，15 min。将数据与Uniprot-Anacardium occidentale（2019.4.20Download）和NCBI-Anacardium occidentale数据库进行比对[32]。

1.2.3.2 圆二色谱（CD）测定腰果过敏蛋白二级结构

首先样品池中不放任何物体，采集背景；后取腰果目的蛋白，分别注入比色皿，置样品池中，按照带宽0.5 nm、步进1.0 nm、波长范围180~260 nm、Timeper-Point 0.5 s、采集三次数据。

1.2.3.3 生物信息软件分析预测 通过NCBI数据库查询过敏原序列与质谱测序进行比较（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAN76862.1?report=genpe pt）。通过DNAstar中的Protean程序预测的二级结构与圆二色谱测定的蛋白结构比对分析。

1.3 数据处理

应用Excel 2007统计分析所有数据，计算误差并制图。

2 结果与分析

2.1 腰果蛋白标准曲线绘制

采用BCA试剂盒微孔酶标法测定蛋白浓度，如图1所示，标准曲线方程为y=0.7343x−0.1009，R2=0.999，方程线性良好。

图1 BCA蛋白质标准曲线Fig.1 BCA protein standard curve

2.2 Sephadex G-150葡聚糖凝胶纯化蛋白

腰果蛋白溶液经脱脂、盐析透析处理后采用Sephadex G-150 葡聚糖凝胶柱进行纯化，用紫外分光光度计检测蛋白含量，根据吸收光谱最大吸收峰波长的位置或吸收峰形状和数量，判断该物质的纯度。将过柱纯化后的蛋白液体每30 s收集一管，依次编号，在 280 nm 波长下检测紫外吸收峰，结果如图2所示。

图2 腰果纯化蛋白溶液紫外图Fig.2 UV image of cashew purified protein solution

如图2所示，葡聚糖凝胶柱层析纯化。根据郎伯-比尔定律，蛋白溶液在最大吸收波长处的吸光度与浓度成正比。蛋白通过凝胶柱层析纯化后收集合并3~5管蛋白液，备用。

2.3 腰果过敏蛋白电泳及免疫印迹鉴定

将葡聚糖凝胶纯化后的腰果蛋白收集后采用SDS-PAGE电泳分析蛋白分子量，采用Western-Blotting评价腰果蛋白过敏性。

结果如图3~图4所示，目标蛋白在SDS-PAGE电泳图中呈现四条蛋白聚集条带和一些弥散性的蛋白条带，通过Western-Blotting免疫印迹图谱显示在33和17 kD出现印迹条带，分析目标蛋白的过敏原组分，可知在33与17 kD与阳性血清有免疫学反应和特异性结合反应，与相关文献报道[20]的腰果的过敏蛋白Ana o 2与Ana o 3分子条带接近，可以初步判断该蛋白为目标天然腰果过敏蛋白Ana o 2与Ana o 3。

图3 腰果过敏蛋白SDS-PAGE分析图Fig.3 SDS-PAGE analysis of allergic protein

图4 腰果过敏蛋白免疫印迹鉴定图Fig.4 Western-Blotting identification of allergic protein

2.4 腰果过敏蛋白质谱序列分析

如图5、表1和表2可知，将质谱图所得数据与

表1 腰果过敏蛋白Ana o 2匹配肽段Table 1 Sequence analysis of cashew allergy protein Ana o 2

表2 腰果过敏蛋白Ana o 3匹配肽段Table 2 Sequence analysis of cashew allergy protein Ana o 3

图5 腰果过敏蛋白质谱测序分析图谱Fig.5 Protein profile sequencing analysis of cashew allergy （ESI）

Uniprot-Anacardium occidentale （2019.4.20 Download）和生物信息学数据库NCBI-Anacardium occidentale进行比对可知，图谱总数为60842，与鉴定肽段所对应的蛋白个数为5，鉴定谱图所对应的肽段去重复之后的个数Uniprot-Anacardium occidentale为147，NCBI-Anacardium occidentale为148，其中测得的片段序列与NCBI数据库进行对比发现其中两个与数据库中Ana o 2与Ana o 3过敏原序列相匹配。通过腰果过敏蛋白质谱测序分析再次验证了腰果主要过敏原为Ana o 2与Ana o 3，氨基酸序列共有16条易形成过敏表位。

2.5 腰果过敏原二级结构分析

蛋白质二级结构是按多肽链本身通过氢键沿一定方向盘绕、折叠而形成的构象。故二级结构不同，则圆二色谱的色谱带不同，通过圆二色谱区了解蛋白质的二级结构。运用CD光谱对腰果过敏蛋白进行结构测定，如图6为过敏蛋白在180~260 nm范围的CD图谱。二级结构特征对抗原表位有很大的影响，通过圆二色谱及DNAstar中的Protean预测将传统分析方法与生物信息方法相结合使得其相互验证，从而提高腰果天然过敏蛋白结构预测准确性[32]。

图6 腰果过敏蛋白二级结构分析Fig.6 Secondary structure analysis of cashew allergy protein

如图6所示，运用CD光谱对纯化后的蛋白溶液进行结构测定，在180~260 nm范围的CD图谱，从195~260 nm开始ɑ-螺旋从微分区域0.307降到0.122，β-转角从0.177上升到0.224，无规则卷曲从0.328上升到0.540，整体趋势为ɑ-螺旋下降时β-转角与无规则卷曲同时呈上升趋势，且β-转角与无规则卷曲多位于蛋白质表面，键能较低，容易与抗体结合，成为抗原表位的可能性大。其中蛋白表面可及性、柔韧性越多的区域，则表示其越易折叠，且暴露在表面；而抗原性指数则代表了其形成表位能力的强弱，抗原指数高的区域更可能形成表位。

通过DNAstar中的Protean程序预测的Ana o 2与Ana o 3过敏原二级结构图7~图10可知，利用DNAstar Protean软件分析腰果主要过敏蛋白的二级结构和抗原性：用Garnier-Robson、Chou-Fasman 方法对二级结构的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲等进行预测；用 Kyte-Doolittle、Eisenberg方法对蛋白的亲水性进行了预测；用 Karplus-Schulz方法分析蛋白质骨架区柔韧性，预测形成表位与抗体结合的可能性；用Jameson-Wolf方法预测了腰果过敏蛋白的B细胞抗原表位；用Emini方法预测了腰果过敏蛋白的表面可及性。

图10 Ana o 3亲水性、柔韧性、抗原性指数和表面可及性Fig.10 Ana o 3 hydrophilicity, flexibility, antigenicity index and surface accessibility

一般暴露在过敏原分子外部易成为抗原的构象表位，位于疏水性区域内的易形成抗原的线性表位，且蛋白质的亲水性、表面可及性、柔韧性等在形成抗原方面起着重要作用，当亲水性>0，抗原指数>0，表面可及性>1时形成表位的可能性大[31]。从图7~图8可以看出，Ana o 2中有10个主要的区域亲水性较好，6个主要的区域表面可及性好，有 16个区域的抗原指数较高，柔韧性区域分布相对平均。

从图9~图10 可以看出，Ana o 3中有3个主要的区域亲水性较好，5个主要的区域表面可及性好，绝大多数区域的抗原指数较高，柔韧性区域分布在中间波长50~120 nm部位。

图9 Ana o 3二级结构分析Fig.9 Ana o 3 secondary structure analysis

综合分析Ana o 2与 Anao3过敏原蛋白骨架区含有较多的柔韧性区域，该蛋白肽段的柔韧性较大，发生扭曲、折叠的概率升高，容易与抗体在空间上产生结合，形成抗原表位的可能性较大。Ana o 2 N-C 端α-螺旋结构、β-折叠区段和转角区域均存在，所以Ana o 2是致敏性较强的一种亲水性蛋白。Ana o 3的二级结构主要为α-螺旋结构和无规则卷曲结构，N端有仅有少量的β-折叠区段和转角区域，为过敏性较弱的亲水性蛋白。

3 结论

本实验分离纯化腰果过敏蛋白并对其结构进行分析，通过SDS-PAGE电泳结合Western-Blotting免疫印迹获得腰果主要过敏蛋白Ana o 2与Ana o 3，其分子量为33与17 kD左右。应用Uniprot-Anacardium occidentale质谱分析所得数据与和NCBIAnacardium occidentale数据库进行比对，可知图谱总数为60842，与鉴定肽段所对应的蛋白个数为5，鉴定谱图所对应的肽段数Uniprot-Anacardium occidentale为147，NCBI-Anacardium occidentale为148。圆二色谱结果与DNAstar中的Protean程序预测可知，Ana o 2α-螺旋结构、β-折叠区段和转角区域均存在，是致敏性较强的一种亲水性蛋白，β-转角和无规则卷曲在Ana o 2氨基酸序列中出现率总和54%，所在区域为优势抗原表位区。Ana o 3 N 端有仅有少量的β-折叠区段和转角区域，出现率总和12%，Ana o 3的二级结构主要为α-螺旋结构和无规则卷曲结构，也为亲水性过敏蛋白，但形成过敏性表位相对弱。本研究为探究腰果主要过敏原的分子结构和表位预测提供研究基础，也为进一步明确天然腰果主要过敏原结构并对探索腰果致敏机理提供参考。