冷吃兔常温贮藏的风味物质变化规律

袁先铃 ，彭先杰2，陈崇艳，万晓玉，林洪斌

（1.四川轻化工大学生物工程学院，四川自贡 643000；2.成都水井坊酒业有限公司，四川邛崃 611500；3.西华大学食品与生物工程学院，四川成都 610039）

兔肉具有高蛋白、高消化率、高赖氨酸、高卵磷脂、低热量、低脲酸、低脂肪及低胆固醇“四高四低”的特性[1]，富含硒、磷，是维生素B的重要来源，具有抗高血压的重要功能[2]。2019年，亚洲售兔子出约6.75亿只，欧洲售出约1.64亿只。2020年，兔肉产业不断上升，据统计，欧盟的生产规模为1.8亿只[3]。中国是肉兔养殖大国，占世界兔肉消费量的60%[4]，主要以四川、重庆、山东、河南等地为主，占中国兔肉消费的75%。

冷吃兔是四川省自贡市的特色美食，经过腌制、炒制等步骤后冷却，麻辣鲜香，无需加热即可冷食，故称之为“冷吃”。目前自贡市全力打造以冷吃兔为代表的冷吃系列美食，响应四川省“川菜出川”的号召。

冷吃兔产品通常执行的标准为GB 2726-2016，但熟肉在常温贮藏期间受物理、化学及微生物等因素影响，对其的pH、蛋白质含量、脂肪含量等理化指标产生影响，使醛类、酮类、酯类、碳氢化合物、含硫化合物及含氮类等化合物发生改变，进而导致滋味物质及挥发性风味物质发生变化[5]。目前，对冷吃兔的研究仅仅停留在杀菌、保鲜及加工工艺等方向，未对风味物质的研究有任何深入。因此，本研究以常温贮藏的冷吃兔为研究对象，探究冷吃兔风味物质的变化过程，为冷吃兔的工业生产标准化奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

兔肉、香辛料及调味料等 购买于宜宾市天天购超市；5'-腺苷酸（5'-AMP）、5'-鸟苷酸（5'-GMP）、5'-肌苷酸（5'-IMP）、5'-二腺苷磷酸（5'-ADP）、次黄嘌呤（HX） 5种核苷酸标准品 纯度100%，上海源叶生物科技有限公司；甘氨酸（Gly）、蛋氨酸（Met）、丙氨酸（Ala）、天冬氨酸（Asp）、异亮氨酸（Ile）、精氨酸（Arg）、谷氨酸（Glu）、组氨酸（His）、苏氨酸（Thr）、丝氨酸（Ser）、苯丙氨酸（Phe）、缬氨酸（Val）、胱氨酸（Cys）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、赖氨酸（Lys）、脯氨酸（Pro）17种游离氨基酸标准品 分析纯，纯度100%，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；2-乙基丁酸标准品 纯度99%，罗恩试剂；NA营养琼脂海博生物技术有限公司。

Kjeltec 8400自动凯氏定氮仪、SoxTecTM 2055索式浸提仪 中国FOSS公司；1260 Infinity II高效液相色谱仪 美国Agilent公司；L-8900全自动氨基酸分析仪 日本日立公司；TRACETM 1300-TSQ 8000 Evo气相色谱-质谱联仪 美国Thermo Fisher公司；ZDJ-4A自动电位滴定仪 中国雷磁公司；101-3AB电热鼓风干燥箱 北京中兴公司；20 mL顶空进样瓶 美国Supelco公司；Polari5 C18-A柱（250 nm×4.6 nm） 美国 Agilent 公司；VD无菌操作台 河南秋佐仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 冷吃兔的制备 冷吃兔的制备：取出内脏、毛发、筋膜、脂肪、异物和骨头，洗净后切成1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm大小的兔丁。

用大蒜3.75 g、生姜3.75 g、大葱3.75 g、料酒3.75 mL、盐1.25 g在室温（20 ℃）下腌制兔丁20 min后待油炸。将200 mL油菜籽油加热至200 ℃，加入腌好的兔肉500 g，炒20 min后沥干待用。剩下的菜籽油中加入香料（80 g干辣椒、3.75 g大蒜、3.75 g姜、3 g冰糖、15 g青椒、2.5 g八角茴香、2.5 g山奈、3.75 g绿色洋葱、1 g月桂叶、7.5 g陈皮），炒1 min。再加入沥干的兔肉继续炒2 min后，加入调味料（盐1.25 g、味精1 g、鸡精1 g、料酒3.75 mL、酱油4 mL），关火。

将样品冷却至室温（20 ℃），装袋抽真空，置于4 ℃冰箱中备用。

1.2.2 冷吃兔常温贮藏时间的确定 通过菌落总数及挥发性盐基氮（Total Volatile Basic Nitrogen,TVB-N）两个指标来判断冷吃兔的腐败情况，以此确定冷吃兔常温贮藏的时间。

菌落总数测定：参照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[6]。TVB-N含量测定：参照GB 5009.228-2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》[7]，样品每间隔3 d检测一次。

1.2.3 冷吃兔常温贮藏中理化成分的测定 样品的水分含量测定，参考GB/T 5009.3-2016[8]中的“直接干燥法”，使用电热鼓风干燥箱干燥至恒重后测定；样品的蛋白质测定，参考GB/T 5009.5-2016[9]中的凯氏定氮法，经过消化后使用自动凯氏定氮仪测定；样品的脂肪测定，参考GB/T5009.6-2016[10]，使用索式浸提仪测定。样品的pH测定，参考马建荣[11]的方法，使用自动电位滴定仪测定。每个样本测量三次，样品每间隔3 d检测一次。

1.2.4 冷吃兔常温贮藏中滋味物质的测定

1.2.4.1 氯化物的测定 所有样品的氯化物测定，均参考GB/T 5009.44-2016[12]中的“银量法”进行测定。

1.2.4.2 呈味核苷酸的测定 参考DUAN等[13]的方法，将10 g捣碎的冷吃兔肉在50 mL 5% HClO4溶液中匀浆30 s（10000 r/min），在4 ℃离心10 min（10000 r/min），重复一次，合并上清液，使用中速滤纸过滤。用1 mol/L 和0.5 mol/L NaOH调节pH至6.0，过0.22 μm滤膜后待用。样品使用高效液相色谱法检测。色谱条件：Polaris5 C18-A柱（250 nm×4.6 nm），检测波长254 nm，柱温30 ℃。流动相A为0.05 mol/L K2HPO4，B为HPLC级甲醇，A:B=95:5等梯度进样，流速0.8 mL/min，进样量20 μm，检测50 min。

1.2.4.3 游离氨基酸（FAAs）的测定 参考GB/T 5009.124-2016食品中氨基酸的测定[14]：称取0.1 g捣碎的冷吃兔肉于装有10 mL 6 mol/L盐酸的水解管中，滴3滴苯酚。充氮气，抽真空，重复3次后封口。将水解管放入电热鼓风干燥箱中110 ℃水解24 h后取出，冷却至室温。打开水解管，中速滤纸过滤，使用蒸馏水定容于100 mL容量瓶中。取200 μL在干燥箱内减压干燥，加200 μL的pH2.22 柠檬酸钠缓冲溶液，过0.22 μm滤膜，使用高效液相色谱仪检测。

1.2.4.4 非挥发性风味物质的测定分析 味精当量（Equivalent umami concentration（EUC），g MSG/100 g）是谷氨酸钠浓度（MSG，g/100 g），由鲜味氨基酸（Asp或Glu）和5’-核苷酸（IMP、AMP和GMP）协同表示对食品的鲜味值贡献。计算公式如下[15]：式中，EUC相当于谷氨酸钠（g MSG/100 g）；1218：g/100 g协同系数；αi：Asp、Glu 的浓度（g/100 g）；βi：Asp、Glu相当于 MSG 的相对鲜度系数（Asp为0.077；Glu为1）；αj：5'-GMP、5'-AMP、5'-IMP的浓度（g/100 g）；βj：5'-GMP、5'-AMP、5'-IMP相对于5'-IMP的相对鲜度系数（5'-AMP为0.18；5'-IMP为1；5'-GMP为2.3）。

滋味活性值（TAV）是通过计算冷吃兔中呈味物质且贡献显著的计算值的。即TAV值>1，该物质对呈味有贡献；TAV值<1，该物质对呈味几乎没有贡献，由此确定呈味物质[16]。

1.2.5 挥发性风味物质的检测

1.2.5.1 顶空固相微萃取气质联用（HS-SPME/GCMS）检测 参考GUO等[17]的方法：将4 g冷吃兔肉捣碎放入20 mL顶空进样瓶，将老化后的顶空固相萃取头插入进样瓶，50 ℃平衡30 min后置于进样口200 ℃解析5 min。色谱条件：进样口温度200 ℃，不分流进样，色谱柱为DP-WAX，载气流速1 mL/min，柱温箱初始温度为40 ℃，最终温度为200 ℃。质谱条件：离子源温度为280 ℃，传输线温度为260 ℃，扫描范围30~550 m/z。

定性分析：在普库（NIST11、NIST11s）对化合物的质谱进行鉴定，记录匹配度大于等于80的化合物。定量分析：在顶空固相微萃取前加入40 μL 0.2 μg/mL 2-乙基丁酸作为内标，采用面积归一化法计算各化合物的相对浓度，公式如下，

式中：Ci为各风味物质的相对浓度（μg/kg）；Si为各物质的峰面积；S标为内标物的峰面积；mi为样品质量（kg）；m标为内标物质量（μg），本实验内标物的质量为4.0 μg。

1.2.5.2 气味活性值（OAV）的计算分析 气味活性值能表述风味化合物的贡献大小。通过将测定的浓度除以它们各自的气味阈值来计算关键气味的OAV[18]。公式如下：

式中： Ci为风味物质i的相对浓度（μg/kg），Ti该风味物质i的嗅觉阈值（μg/kg）。当0≤OAV<1，说明该风味物质对总体风味无实际作用，对炭烤羊腿风味具有一定的修饰作用；OAV≥1，说明该风味物质可能对总体风味有直接影响，被确定为炭烤羊腿中特征风味物质；OAV值越大说明该组分对总体风味贡献越大。

1.3 数据处理

实验结果通过Excel 2013 对数据进行统计分析，将各个指标用SPSS进行方差分析（ANOVA），用多重比较法分析差异显著性，其中P<0.05表示差异显著[19]。使用Origin 2018软件作图。

2 结果与分析

2.1 常温贮藏的腐败时间

菌落总数是判定食品受细菌污染的程度和检测卫生质量的标准[20]（国标中菌落总数≤105CFU/g[21]）。TVB-N是动物性食品在酶和细菌的作用下，分解蛋白质产生氨及胺类等碱性含氮物质（国标中TVBN含量需≤35 mg/100 g[7]）。由表1可知，菌落总数与TVB-N在15 d显著增加（P<0.05），超过国家标准。因此，探究冷吃兔在贮藏过程中风味物质的变化，将15 d作为实验终点。

表1 冷吃兔常温贮藏的菌落总数及TVB-N含量Table 1 Total number of colonies and TVB-N in cold-eating rabbits stored at room temperature

2.2 常温贮藏过程中的理化成分变化规律

食品中的水分含量能有效影响食品的性质，并与蛋白质、脂肪等非水组分通过一定的方式相互作用[22]。蛋白质不但能影响肉制品硬度，还能被降解成多肽及硫氨基酸进而影响风味物质的产生[23]。脂肪在贮藏中发生氧化及水解等反应，能产生醛类、酮类等，使产品的风味物质收到改变。pH能影响半胱氨酸与还原糖反应中风味物质的形成[24]，使产品的品质发生变化。

冷吃兔在常温贮藏中的水分、蛋白质、脂肪及pH含量如图1所示。在0~15 d，水分含量范围为20.98%~27.85%。水分含量变化显著（P<0.05），可能是微生物对水分进行充分的利用，总体水分含量较高，有益于微生物的繁殖。蛋白质含量为25.15%~27.9%，脂肪含量为24.06%~27.21%，其中，蛋白质及脂肪含量显著降低，均降低了2.47%（P<0.05），可能是由于蛋白质及脂肪氧化或降解等反应所造成的，与腊肉贮藏期间发生蛋白质及脂肪氧化相类似[25]。pH由0 d贮藏时的6.09增加到3 d的6.11，再显著下降至9 d的5.92（P<0.05），之后又呈上升趋势。pH下降的主要原因可能是蛋白质的氧化能产生羰基化合物进而继续氧化成酸类物质[26]，亦或者是菌分解碳水化合物产酸使pH降低。之后pH升高，可能是细菌繁殖产生的蛋白酶将蛋白质分解成呈碱性的胺类物质[27]。

图1 冷吃兔常温贮藏中理化指标的变化Fig.1 The changes of physical and chemical indexes in coldeating rabbit at room temperature storage

2.3 常温贮藏过程中的滋味物质变化规律

2.3.1 冷吃兔常温贮藏过程中氯化物含量及TAV值分析 氯化物是食品中重要的咸味贡献者，能与游离氨基酸或核苷酸等其他物质协同作用产生风味物质。如表2所示，氯化物的含量在0~6 d显著增加（P<0.05），在9~15 d显著下降（P<0.05）。在6 d时，含量达到最高，为1.19 g/100 g，可能是随着水分含量的降低，且氯化钠不断地渗透，使其含量增加。脂肪阻止氯化物的迁移，使其含量降低[28]。氯化物的含量均在阈值之上，能有效呈现出咸味。

表2 常温贮藏过程中氯化物含量及TAV值Table 2 Chloride content and TAV value during storage at room temperature

2.3.2 常温贮藏过程中核苷酸分析 不同呈味核苷酸的呈鲜味效果不同，其对肉品鲜味的贡献度主要取决于呈味强度值。研究发现，具有鲜味特征的核苷酸及其衍生物为30多种芳香杂环化合物，以5’-肌苷酸、5’-鸟苷酸和5’-腺苷酸三种为代表，当核糖中出现5’位碳原子上具有磷酸基团、嘌呤中6’位碳原子上具有一个羟基或鲜味核苷酸均为嘌呤类时，核苷酸具有呈鲜味的特性[30]。

由表3可知，常温贮藏条件下冷吃兔中的主要呈鲜味核苷酸是5’-IMP，在3 d时达到最大值40.65 mg/100 g，是冷吃兔的特征滋味物质，之后降低14.35 mg/100 g。结合TAV值，由1.63降至1.05，但依旧是鲜味的主要贡献者，与大黄鱼中有较高含量的IMP结果相似[31]，可能是由于5’-IMP稳定性最差，易分解[32]。5’-GMP也在略微下降，两者下降的原因可能是通过ATP在酶的作用下发生降解或者随着核苷酸底物的消耗导致的，这与鸡肉在常温阶段中呈味核苷酸的变化类似[33]。随着贮藏时间的延长，呈甜味氨基酸5’-AMP及呈苦味氨基酸HX在0~6 d无显著变化（P>0.05），15 d时增加。其中5’-GMP 、5’-AMP、5’-ADP及HX的TAV均<1，对冷吃兔的风味几乎没有影响或影响很小。根据核苷酸的总含量可以看出，在常温贮藏期间，呈味核苷酸呈下降趋势且显著（P<0.05），在0~6 d中无明显变化，9 ~12 d中无明显变化。因此，可将贮藏6 d作为呈味核苷酸变化的关键时间点，此时鲜味呈现效果最明显。

表3 贮藏过程中的呈味核苷酸含量及TAVTable 3 Taste nucleotide content and TAV in the storage process

2.3.3 常温贮藏过程中游离氨基酸分析 游离氨基酸对风味物质有重大的影响。从表4得出，冷吃兔中的游离氨基酸含量降低。结合TAV值，游离氨基酸总TAV呈显著降低趋势（P<0.05），其中，鲜味氨基酸的TAV降低最剧烈，由10.73降低至3.89，在0 d时TAV最大，3~6 d时，无明显变化，之后显著降低（P<0.05），其中，Glu在3~15 d下降最显著（P<0.05），降低了5.69，可能其受到分解，导致贮藏过程中鲜味降低的重要原因。Glu是冷吃兔的主要呈鲜味氨基酸，在贮藏期间TAV均>1，保持了冷吃兔具有特征鲜味的特性。Asp的TAV在3~15 d降低了0.29，始终小于1，即在冷吃兔贮藏期间无鲜味贡献或贡献较小。Glu与Asp的降低可能是因为氨基酸降解或与其他物质作用导致。甜味氨基酸含量的TAV在0~6 d增加了0.32后降低0.62，在6 d达到最大值，可能是蛋白质在该条件下热解生成氨基酸及肽类。而苦味氨基酸在贮藏期间增加了2.23，其中，15 d增加显著（P<0.05）。

表4 常温贮藏过程中游离氨基酸的TAVTable 4 TAV of free amino acids during storage at room temperature

2.3.4 冷吃兔常温贮藏过程中滋味活性值变化（EUC）由表5可知，结合MSG滋味阈值（30 mg/100 mL），随着贮藏时间的延长，冷吃兔的滋味活性值均高于MSG鲜味阈值。即Asp、Glu与5'-IMP、5'-AMP与5'-GMP协同作用使冷吃兔的呈鲜味增强。0~15 d间显著降低了14.33 gMSG/100 g（P<0.05），在0 d时达EUC最大为19.49 gMSG/100 g，0~6 d内EUC减少不显著（P>0.05），9~15 d降低显著（P<0.05）。结合EUC，可将6 d作为冷吃兔滋味流失的关键时间点。

表5 冷吃兔常温贮藏过程中的EUC值Table 5 EUC value of cold-eating rabbit during storage at room temperature

2.4 常温贮藏过程中的挥发性风味物质变化规律

如表6可知，通过HS- SPME/GC-MS对常温贮藏期的冷吃兔的风味进行检测。随着贮藏时间的进行，共检测出10大类62种化合物，分别检测风味物质种类如表7。化合物种类在0~6 d增加，6~15 d降低，其中柠檬醛、（E,E）-2,4-癸二烯醛、十六醛、芳樟醇、苄醇、苯乙醇、茴香脑、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚等特征风味物质含量都降低（P<0.05），可能是因为油脂的酸败等导致冷吃兔的特征风味物质明显降低。将0 d与6 d对比发现，检测出的风味物质种类及相对含量最相似。共检测出19种化合物贯穿于贮藏期间，其中芳樟醇与茴香脑的含量最高。

表6 冷吃兔常温贮藏过程中的风味物质含量Table 6 Flavor substance content of cold-eating rabbit during storage at room temperature

表7 冷吃兔常温贮藏过程中的风味物质种类Table 7 Types of flavor substances in cold-eating rabbits during storage at room temperature

醛类化合物主要来源于脂肪的氧化降解及酶或微生物的氧化所形成，是熟制品的主要风味化合物。在检测到的8种醛类中，壬醛、反式-2-癸烯醛、柠檬醛、（E,E）-2,4-癸二烯醛及十六醛一直存在于贮藏期中，呈显著降低趋势（P<0.05）。其中，壬醛的含量最高，其次是十六醛。醇类主要由肌肉中的共轭亚油酸被脂肪氧合酶和氢过氧化酶降解产生。在检测到的11种醇类中，芳樟醇、（-）-4-萜品醇、alpha-松油醇及苯乙醇是共同存在的，随着贮藏时间的延续，它们的含量呈显著下降趋势（P<0.05）。其中芳樟醇的含量最高，其次为（-）-4-萜品醇。酸类化合物是一般脂肪氧化降解为低级脂肪酸产生[34]。其中，辛酸、硬脂酸及棕榈酸酸一直存在于贮藏期。棕榈酸的含量最高，其次为硬脂酸，可能是硬脂酸为饱和脂肪酸，因分子内不存在双键而比较稳定，不易被氧化。萜类中姜烯的含量较高，也是姜粉中为主要挥发性风味物质[35]。醚类中，茴香脑的含量较高，与张丽珠等[36]研究棕榈油与菜籽油复合火锅底料中检测出高含量的芳樟醇与茴香脑的结果相似。

续表 6

3 结论

冷吃兔在常温贮藏期间，氯化钠的含量均在阈值之上，能有效呈出咸味。鲜味氨基酸中Glu下降最显著（P<0.05），但TAV均>1，使冷吃兔保持了特征鲜味。主要呈鲜味核苷酸是5’-IMP，依旧是鲜味的主要贡献者，5’-GMP 、5’-AMP、5’-ADP及HX的TAV均<1，对冷吃兔的风味几乎没有影响或者影响很小。根据核苷酸的总含量可以看出，贮藏6 d是呈味核苷酸变化的关键时间点。结合MSG滋味阈值（30 mg/100 mL），随着贮藏时间的延长，冷吃兔的滋味活性值均高于MSG鲜味阈值。即Asp、Glu与5'-IMP、5'-AMP与5'-GMP协同作用使冷吃兔的呈鲜味增强。结合EUC，冷吃兔常温贮藏中滋味物质一直降低，9~15 d降低显著（P<0.05），0~6 d无明显变化，因此，可将常温贮藏第6 d作为冷吃兔滋味流失的关键时间点。挥发性风味物质风味共检测出10大类62种化合物。其中，与0 d进行对比得出在第6 d时检测出的风味物质种类及相对含量最相似，共检测出19种化合物贯穿于贮藏期间，其中芳樟醇与茴香脑的含量最高。

综上所述，冷吃兔在常温贮藏6 d后，滋味物质及挥发性风味物质出现明显的变化，6 d前食用常温贮藏的冷吃兔具有较好的风味。