circ_0007897通过调控PDCD4介导缺血性心肌损伤的机制研究

洪承吕 高瞻 施翔翔 周希

研究显示，在急性心肌缺血发生后，尽早恢复缺血区心肌血流供应是减小心肌梗死面积最有效的治疗措施[1]。环状RNA（circular RNA，circRNA）是一类由前体mRNA 成熟时外显子反向剪切形成的单链、闭合RNA。circRNA 绝大多数存在于细胞质中[2]，部分含有内含子的circRNA 也可以定位于细胞核内[3]。正常成年人的心肌组织测序发现有300 多种circRNA 的富集，circRNA 在心肌组织中有丰富的表达。目前认为circRNA的功能包括调节转录[4]、结合蛋白[5]及miRNA 海绵[6]等，与肿瘤、心血管等多种疾病的发生发展有着密切关联。

程序性细胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）是近年来新发现的重要的抑癌基因，最初研究表明其在致瘤性转化小鼠表皮细胞模型中能抑制由致癌物质诱发的致瘤性转化[7]。目前研究发现PDCD4 基因敲除后能减轻对白介素10 翻译的抑制，导致抗炎因子白介素10的表达升高，白介素6的产生减少，从而抑制炎症的发生，在肿瘤、肥胖、糖尿病和心血管等疾病的发生发展中发挥重要作用[8～10]。

本研究拟通过分离小鼠的原代心肌细胞缺血模型中mmu_circ_0007897 的作用，通过体外实验探索mmu_circ_0007897 基因是否为调控心肌缺血过程中的重要因子，以及circRNA 的靶基因PDCD4 的调控机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 新生C57BL/6 近交品系健康清洁型小鼠，约1～3 d 的乳鼠，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司。

1.2 实验试剂与仪器 circ_0007897 过表达慢病毒（由中洪博元公司生产）；DMEM/F-12（由美国Gibco 公司生产）；circ_0007897 探针（由美国BOSTER 生产）；α-SMA（由英国abcam 公司生产）；cTn I（由美国proteintech 公司生产）；Annexin VFITC/PI Apoptosis Kit（由杭州联科生物技术有限公司生产）；Trizon Reagent（由康为世纪有限公司生产）；Ultrapure RNA 超纯RNA 提取试剂盒（由康为世纪有限公司生产）；小鼠乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）试剂盒（由酶免公司生产）；小鼠丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒（由酶免公司生产）；PVDF膜（IPVH00010，Millipore）；超敏发光液（由赛默飞公司生产）；Rabbit Polyclonal Anti-Beta T（由上海合星生物科技有限公司生产）；荧光显微镜（由OLYMPUS 生产）；ubulin（由美国Proteintech公司生产）；Rabbit Anti PDCD4（由上海爱必信生物科技有限公司）；NovoCyte™流式细胞仪（由杭州艾森生物有限公司生产）；荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪［由伯乐生命医学产品（上海）有限公司生产］；全自动酶标仪（由北京市六一仪器厂生产）；蛋白垂直电泳仪（由北京市六一仪器厂生产）；超高灵敏度化学发光成像系统（由上海伯乐生命医学产品有限公司生产）。

1.3 造模及分组 空白组：分离小鼠的原代心肌细胞，常氧条件下细胞培养造模。缺氧复氧组：分离小鼠的原代心肌细胞，在缺氧6 h 复氧1 h 培养箱中培养造模。缺氧复氧+circ_con 组：用对照基因过表达干预按照慢病毒操作手册进行操作，MOI=100，转染4 d，在缺氧6 h 复氧1 h 培养箱中培养造模。缺氧复氧+circ_0007897 组：circ_0007897 基因过表达干预按照慢病毒操作手册进行操作，MOI=100，转染4 d，在缺氧6 h复氧1 h培养箱中培养造模。

1.4 分离小鼠的原代心肌细胞 取新生C57 小鼠心脏，剔除心脏外膜和血管，剪取心尖，用眼科剪将组织剪至淤泥状，自然沉降，去除上清，加入消化液胶原酶I 1 g/L 37 ℃消化30 min，每5 min 收集一次消化液加入完全培养基中终止。置于离心机1 000 r/min 离心5 min，弃去上清液，加入适量培养液将细胞制成悬液，差数贴壁法纯化心肌细胞：细胞悬液接种培养皿中，置于37 ℃，5%CO2条件下静置30 min，2 次，吸出培养液置于另一皿中放入培养箱中培养。

1.5 免疫荧光鉴定 在培养板中将已培养好的细胞的培养皿用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）浸洗3 次，每次3 min；用4%的多聚甲醛固定15 min，再用PBS 浸洗培养皿3 次，每次3 min；用0.5%Triton X-100（PBS 配制）室温通透20 min。PBS 浸洗培养皿3 次，每次5 min，移液枪吸干PBS，在培养皿上滴加5% 牛血清白蛋白溶液（bovine serum albumin，BSA），37 ℃封闭30 min。移液枪吸掉封闭液，每个培养皿滴加足够量的稀释好的一抗α-SMA（1：400），4 ℃孵育过夜；PBS 浸洗培养皿3 次，每次3 min，移液枪吸干培养皿内多余液体后滴加稀释好的荧光二抗Cy3（1：200），37 ℃孵育30 min，PBS 浸洗培养皿3 次，每次3 min；从加荧光二抗起，所有操作步骤都尽量在较暗处进行。PBS浸洗培养皿3 次，每次5 min，用移液枪吸干PBS，在培养皿内滴加5% BSA，于37 ℃封闭30 min。用移液枪吸掉PBS，每个培养皿内滴加足够量的稀释好的一抗cTn I（1∶200），37 °C 孵育3 h。培养皿复温至室温后，PBS 浸洗培养皿3 次，每次5 min，移液枪吸干培养皿内多余液体后滴加稀释好的荧光二抗羊抗兔IgG/488（1∶200），37 ℃孵育30 min，PBS 浸洗切片3 次，每次5 min；滴加4，6-联脒-2-苯基吲哚（4，6-diamino-2-phenyl indole，DAPI）避光孵育5 min，对标本进行染核，用PBS 浸洗多余的DAPI；用20%甘油封闭培养皿，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

1.6 检测细胞凋亡 收集1×106～3×106个细胞，加1 ml PBS 1 500 r/min 离心3 min，洗2 次。用双蒸水将5×Binding Buffer 稀释为1×Binding Buffer。取300 μl 预冷的1×Binding Buffer 重悬细胞。每管各加入5 μl Annexin V-FITC 和10 μl PI。轻微混匀后，室温避光孵育10 min 。再向每管中加入200 μl预冷的1×Binding Buffer。混匀后上流式仪检测。

1.7 实时荧光定量PCR 各组提取RNA 后根据逆转录试剂盒合成cDNA，以cDNA 为模板，在荧光定量PCR 仪上进行检测，以β-actin 为内参，算出各组中PDCD4 和circ_0007897 的相对表达量。引物见表1。

表1 引物序列

1.8 CCK8 检测 按上述分组进行铺板，0 h，24 h后，每孔加10 μl CCK8 检测试剂，在37 ℃孵育2 h；酶标仪在450 nm 波长处检测每孔的吸光度值计算存活率。

纳入网络分析的关键词频次分布如表1所示，共出现频次275次，占全部关键词总频次的53.82%。在关键词中，出现频次最高的三个关键词是 “日本” “东北地区” “日本移民”，可见我国日本移民研究中，关于日本在东北地区的移民侵略研究是重中之重；其次， “农业移民” “满洲移民” “美国” “关东军” “移民政策”等的学术研究也是当前的热点。

1.9 ELISA 检测 分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中加样品50 μl，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。每孔加入酶标试剂100 μl，空白孔除外。用封板膜封板后置37 ℃温育60 min。将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20 倍稀释后备用。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s 后弃去，如此重复5 次，拍干。每孔先加入显色剂A 50 μl，再加入显色剂B 50 μl，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min。每孔加终止液50 μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度值。测定应在加终止液后15 min以内进行。

1.10 Western blot 蛋白提取掉培养皿中细胞培养液，每孔加入100 μl的细胞裂解液，置于冰上15 min，用枪头将细胞吹打下来，放入已做好标记的EP 管中，12 000 r/min 离心10 min。取上清液，移至新的EP 管（BCA 测定），弃沉淀，按100 μl 裂解液加入25 μl 5×loadingbuffer 缓冲液，沸水煮5 min，置于-20 ℃保存。按照BCA 蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定量。根据定量结果计算出蛋白电泳上样体积。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，抗原抗体反应，化学发光和显影。

1.11 统计学方法 采用SPSS 20.0软件。计量资料用均数±标准差（）表示，组间采用单因素方差分析和采用q检验。设P＜0.05为差异具统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞活力、细胞凋亡、细胞LDH 水平及细胞内MDA含量结果见表2

表2 各组细胞活力、细胞凋亡、细胞LDH水平及细胞内MDA含量

由表2 可见，与空白组比较，缺氧复氧组的细胞活力明显下降，细胞凋亡明显升高，LDH 水平及细胞内MDA 明显升高，差异具有统计学意义（q分别=13.86、40.78、14.45、8.12，P均＜0.05）；与缺氧复氧组相比，缺氧复氧+circ_0007897 组的细胞活力明显升高，细胞凋亡明显下降，LDH 水平及细胞内MDA明显下降，差异具有统计学意义（q分别=9.68、20.96、9.13、8.18，P均＜0.05）。

2.2 各组细胞中circ_0007897 和PDCD4 表达结果见图1

图1 各组细胞中circ_0007897和PDCD4表达结果

如图1a、1b 所示，与空白组相比，缺氧复氧组的circ_0007897表达明显下降，PDCD4的表达明显升高，差异具有统计学意义（q分别=8.91、9.70，P均＜0.05）；与缺氧复氧组相比，缺氧复氧+circ_0007897 组的circ_0007897 表达水平明显升高，PDCD4 表达水平明显下降，差异具有统计学意义（q分别=14.84、6.51，P均＜0.05）。缺氧复氧组与缺氧复氧+circ_con 组之间circ_0007897、PDCD4 的表达水平比较，差异不具有统计学意义（q分别=2.41、0.14，P均＞0.05）。

3 讨论

PDCD4 在许多病理生理过程中发挥重要的作用，尤其是在细胞死亡和炎症反应过程中发挥重要作用，因此广泛参与癌症、自身免疫紊乱和动脉粥样硬化等多种疾病的发生发展过程[11]。有研究发现肾缺血再灌注诱导急性肾损伤后肾脏PDCD4 表达水平显著升高，并且在缺血再灌注肾活检病人组织中PDCD4 的表达显著升高[12]。通过PDCD4 敲基因鼠进一步研究结果表明PDCD4 缺失通过阻断细胞死亡和炎症反应，显著改善肾缺血再灌注后肾功能障碍和组织损害[13]。研究发现，PDCD4 可能通过调控Fgr-Notch1 介导的细胞死亡和炎症通路，加重肾缺血再灌注损伤，阻断该通路上的分子，有望改善肾缺血再灌注损伤[14]。本次研究结果也发现，心肌细胞在进行缺氧复氧处理后，细胞中PDCD4 的表达显著升高。这些结果说明PDCD4 在缺血再灌注损伤中具有重要的作用，并且丰富了缺血再灌注损伤的理论研究并为其临床治疗提供了靶点，具有重要的理论意义和临床价值。

为了进一步明确circ_0007897对心肌细胞是发挥保护作用还是损伤作用，本研究通过构建过表达circ_0007897 慢病毒，并通过荧光定量PCR 验证其过表达效果，结果发现，过表达circ_0007897 慢病毒具有明显提高circ_0007897 表达的效果。并且本研究检测了circ_0007897 对心肌细胞活力和凋亡的影响，结果发现心肌细胞在经历缺氧复氧后细胞活力明显下降，细胞凋亡明显升高；过表达circ_0007897后，细胞活力得到改善并细胞凋亡也明显下降，提示circ_0007897 对细胞有明显的保护作用。并且结果也发现过表达circ_0007897 后，细胞中PDCD4 表达明显下调，这结果说明circ_0007897 对细胞有明显的保护作用可能是通过下调PDCD4 来进行调控的。

心肌细胞缺血损伤因素众多而且复杂，其中氧自由基是造成缺血损伤的直接原因之一[15]。心肌细胞在缺氧条件下ATP 产生减少、代谢障碍，代谢产物堆积使膜稳定性降低，溶酶体释放，导致生物损伤、变性，使LDH 释放在培养基中，同时再给氧时氧自由基增加，导致细胞膜损伤，细胞内LDH 释放进一步增加[16]。缺氧刺激可引起心肌细胞DNA 的氢键断裂、碱基降解和主链解旋，其中脂质过氧自由基和烷氧自由基可引起DNA 碱基的氧化，其代谢产生MDA 还可导致DNA 链断裂和交联[17]。脂质过氧化产物MDA 含量变化可作为评定氧自由基生成及对膜脂质双层结构破坏的指标[18]。本研究结果发现，心肌细胞在缺氧复氧处理后细胞中LDH和MDA的含量都明显升高，而过表达circ_0007897 能使细胞中的LDH 和MDA 含量降低，这结果也说明circ_0007897对心肌细胞有明显的保护作用。

综上所述，circ_0007897 对心肌细胞有明显的保护作用，而这种保护作用是通过下调PDCD4 来进行调控的。但是，本研究仅限于体外细胞实验，还需构建体内动物模型来进一步研究circ_0007897 对心肌细胞缺血再灌注损伤的机制。