磷水平与丛枝菌根真菌对桔梗生长及品质的影响

李楠海 孙卓 杨利民

（吉林农业大学中药材学院，长春 130118）

桔 梗［Platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC.］为桔梗科多年生草本植物，其根及根茎入药［1］，性苦、辛，平，归肺经，有宣肺、利咽、祛痰、排脓的功效［2］。丛枝菌根（arbuscular mycorrhizal，AM）真菌作为一种绿色有效的生物肥料广泛应用于作物栽培领域，然而土壤磷水平会在某种程度上制约菌根共生体的生长［3］，高磷或低磷均不利于AM真菌侵染宿主植物，甚至会抑制宿主植物生长［4］。对于药食同源的桔梗而言，如何提高桔梗产量的同时提高其药用成分含量一直是重要的研究课题。近年来，AM真菌对植物的促生效应越来越受到重视，但关于AM真菌与桔梗共生效应的研究较少，不同土壤磷水平下AM真菌与桔梗的共生关系尚不明确。因此，本研究通过对盆栽桔梗试验，分析不同土壤磷水平条件下不同AM真菌对桔梗产量及质量的影响，确定AM真菌和磷水平的最佳组合，为科学使用AM真菌提高桔梗品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试桔梗种子采收自吉林农业大学药用植物园，经吉林农业大学杨利民教授鉴定为桔梗科植物桔梗［Platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC.］的种子。供试AM真菌菌种：摩西斗管囊霉（Funneliformis mosseae，FM）、 根 内 根 孢 囊 霉（Rhizophagus intraradices，RI）和象牙白多样孢囊霉（Diversispora eburnea，DE）均购于北京市农林科学院植物资源与营养研究所（BGC编号和国家微生物资源平台编号分别为BGC BJ01，1511C0001BGCAM0010；BGC BJ09，1511C0001BGCAM0042；BGC XJ06B），接种剂为经三叶草和高粱扩繁后获得的含有孢子、菌丝、侵染根段的沙子、沸石混合物，测定各菌剂接种势［5］分 别 为 913.68（IP/g）、1 994.21（IP/g）、1 251.61（IP/g）。供试肥料为磷酸二氢钠。供试土壤pH值6.76；速效磷20.75 mg/kg，碱解氮23.80 mg/kg；速效钾222.81 mg/kg；有机质含量2.71%。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 本试验在吉林农业大学温室中进行。共设 4个磷水平，P0（20 mg/kg）、P1（50 mg/kg）、P2（80 mg/kg）、P3（140 mg/kg）；同一磷水平4个处理，接种摩西斗管囊霉（FM）、根内根孢囊霉（RI）、象牙白多样孢囊霉（DE）及不接种处理（CK）。试验盆随机排列，2019年将桔梗种子直播于塑料盆中，每盆装土5 kg，FM、RI、DE处理组分别层施接种剂100 g、47 g、73 g，接种势约为91 368（IP/g），不足100 g的菌剂加入灭菌菌剂补足。CK处理组加入相同质量的灭菌菌剂以保持微生物区系一致。生长期间，常规管理，于2020年收获。

桔梗样品取回后用清水冲洗干净，并用滤纸吸干水分。选取细嫩，坚韧的根，剪成1 cm左右的根段，放入FAA固定液中固定，用于菌根侵染率率的测定；将桔梗叶片组织分装于冻存管，液氮冷冻贮存于-80℃冰箱，用于保护酶活性、渗透调节物质及丙二醛含量的测定，称取桔梗根鲜重，使用游标卡尺量取桔梗株高、茎粗、根粗等指标并记录。将桔梗根置于烘箱中低温烘干至恒重后，测定桔梗样品根干重，将样品粉碎后保存，用于桔梗皂苷测定。

1.2.2 侵染率测定 菌根侵染率测定参考Vierheilig等［6］方法：从固定液中取出根段，用水冲洗干净，放入试管中，加入10% KOH浸没根段，在水浴90℃煮1 h，然后倒出KOH，并以清水洗净。再向试管中加入墨水醋染色剂，煮开10 min，倒出染色剂，并以清水清洗干净，制片观察。

1.2.3 保护酶及渗透调节物质测定 超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛（MDA）和脯氨酸（PRO）的测定采用南京建成生物工程研究所的试剂盒。

1.2.4 桔梗皂苷测定 桔梗皂苷采用超声波提取法，测定参考岳虹等［7］方法：称取桔梗粉末2 g，准确加入80%甲醇30 mL，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，离心并过滤，重复3次，合并滤液，最后定容至2 mL容量瓶备用。提取液过0.22 μL微孔滤膜，采用HPLC-ELSD法测定桔梗根中桔梗皂苷含量，色谱柱：C18分析柱（250 mm×4.6 mm），DAD检测器，流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；ELSD检测器，漂移管温度为75℃，雾化管温度75℃，载气（N2）流量为2.5 L/min；进样量：12 μL，流动相：乙腈（A）和0.2%甲酸（B）。以峰面积为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，根据标准曲线方程，计算各桔梗皂苷含量。

1.2.5 桔梗总皂苷测定 桔梗总皂苷测定采用香草醛—硫酸比色法，参考张坚等［8］方法：精确称取3.8 mg桔梗皂苷D置10 mL容量瓶中，甲醇定容得对照品溶液。称取对照品溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL置10 mL具塞试管中，水浴干燥后加入10%香草醛试液0.5 mL，60%硫酸4.5 mL，于60℃水浴加热15 min，冰水浴中冷却3 min，以不加皂苷的样品为空白对照，检测波长470 nm，得回归方程Y =0.0007X-0.0263，R2=0.999 6，计算桔梗总皂苷含量。

1.2.6 数据分析 采用Microsoft Excel 2010进行数据处理分析与整理，以 SPSS 20.0 和 DPS 19.0 进行数据统计分析，采用Orign 2018 64bit软件制图。

2 结果

2.1 不同磷水平AM真菌对桔梗侵染效果分析

2.1.1 不同磷水平AM真菌对桔梗侵染率、侵染强度的探究 从图1中可以看出，在同一磷水平时，接种FM、RI和DE的处理侵染率均显著高于未接种处理（P＜0.05）。土著菌对未接种植株也具有一定侵染率，且各处理侵染率均随着磷水平的升高而升高，且在P2水平达到最大值（RI除外），分别为57.7%、38.3%、41.7%。侵染强度的变化与侵染率的变化大体趋势一致，在同一磷水平，接种3种AM真菌的处理侵染强度均显著高于未接种处理（P＜0.05），随着磷水平的升高而升高，且在P2水平达到最大值，3种处理侵染强度分别为50%、30%、25%。在同一水平下，接种FM真菌的处理侵染率和侵染强度均高于RI和DE处理，说明FM与植物的亲和力大于RI和DE。由此可见适量的磷能促进菌根的侵染，而过量磷反而抑制其侵染。

图1 AM真菌和磷水平对桔梗侵染率、侵染强度的影响Fig.1 Effects of AMF and phosphorus level on the infection rate and infection intensity of P. grandiflorum

2.1.2 不同磷水平土壤中AM真菌的孢子量的探究 由图2可知，未接种处理中也发现了真菌孢子，应该为土壤中土著菌产生。在同一磷水平下接种FM处理组显著高于其他处理组（P＜0.05），无论在何种磷水平时，接种3种AM真菌的处理土壤AM真菌孢子数均显著高于未接种处理（P＜0.05）。接种处理与未接种处理的土壤AM真菌孢子数随着磷水平的升高而升高，且在P2水平达到最大值，分别为215个/克土、205个/克土、133个/克土。

图2 AM真菌和磷水平对土壤AM真菌孢子数的影响Fig. 2 Effects of AMF and phosphorus level on the spore number of AMF in soil

2.2 不同磷水平AM真菌对桔梗生物量的影响

由表1可知，接种FM、RI和DE后，桔梗株高、根干重、根鲜重、根粗、根长均有不同程度的提高，且随着磷水平的升高呈现出先升高后下降的趋势，在P2水平时达到最大值。在P2水平下，与未接种对照相比，桔梗株高差异不显著；桔梗根干重分别增加43%、31%、7%；桔梗根鲜重分别增加114%、62%、90%；桔梗根粗分别增加26%、25%、24%。双因素方差分析结果（表2）表明，磷水平对桔梗株高、根干重、根鲜重、根粗、根长有显著影响（P＜0.05）；AM真菌对桔梗株高、根干重、根鲜重、根粗、根长有显著影响（P＜0.05）；且二者对桔梗株高、根干重、根鲜重有显著交互作用（P＜0.05）。

表1 AM真菌和施磷量对桔梗生物量的影响Table 1 Effects of AMF and phosphorus application rate on P. grandiflorum biomass

表2 磷水平和AM真菌对桔梗生长指标的双因素方差分析Table 2 Two-way ANOVA of phosphorus level and AMF on the growth indexes of P. grandiflorum

2.3 不同磷水平AM真菌对桔梗抗逆性的影响

2.3.1 不同磷水平AM真菌对桔梗保护酶活性的影响 根据图3可知，接种AM真菌后的植株其SOD、POD活性较未接种植株有明显提高（P＜0.05），随着磷水平的升高，无论是接种植株还是未接种植株其SOD活性均呈现出先升高后降低的趋势，且在P2水平时达到最大值分别为720.25 U/g、655.78 U/g、623.88 U/g，较CK组分别提高了25%、14%、8%。在同一磷水平下，3种接种AM真菌处理的POD活性大小分别为，FM＞RI＞DE，且在P2水平达到最大值分别为156 U/g、150.67 U/g、136 U/g，较CK组分别提高了25%、21%、9%。

图3 不同处理桔梗叶中保护酶活性变化Fig. 3 Variations of protective enzyme activities in P.grandiflorum leaves under different treatments

2.3.2 不同磷水平AM真菌对桔梗渗透调节物质和丙二醛含量的影响 由图4可知，在同一磷水平下，接种FM、RI和DE后，其可溶性糖和可溶性蛋白含量均显著高于未接种植株（P＜0.05）。随着磷水平的不断升高，可溶性糖和可溶性蛋白均呈现出先上升后下降的趋势，且在P2水平时达到最大值。在P2水平时，与未接种处理相比，可溶性糖分别提高71%、70%、38%；可溶性蛋白分别提高75%、52%、16%。根据图4可知，在同一磷水平下，接种AM真菌后的植株二者含量均显著低于未接种植株（P＜0.05），说明接种AM真菌可在一定程度上降低脯氨酸和丙二醛含量，从而缓解植株遭受的环境胁迫，增强植株抗逆性。

图4 不同处理桔梗叶中渗透调节物质及丙二醛含量变化Fig. 4 Changes of osmotic adjustment substance and malondialdehyde content in P.grandiflorum leave under different treatments

双因素方差分析结果（表3）表明，磷水平和AM真菌均对桔梗叶片SOD、POD、可溶性糖、可溶性蛋白、MDA、PRO有显著影响（P＜0.05）；且二者对桔梗桔梗叶片SOD、POD、可溶性糖、可溶性蛋白、MDA、PRO有显著交互作用（P＜0.05）。

表3 磷水平和AM真菌对桔梗抗性指标的双因素方差分析Table 3 Two-way ANOVA of phosphorus level and AMF on resistance index of P.grandiflorum

2.4 不同磷水平AM真菌对桔梗皂苷积累的影响

由图5可知，在同一磷水平下，接种后的植株桔梗皂苷含量均显著高于未接种植株（P＜0.05）。接种FM、RI和DE后，桔梗皂苷含量随着磷水平的升高呈现先升高后下降的趋势，且在P2水平达到最大值。在P2水平下，与未接种对照相比，桔梗皂苷D含量分别增加20%、18%、16%；桔梗皂苷D3含量分别增加29%、11%、22%；去芹糖桔梗皂苷D含量分别增加22%、5%、8%；去芹糖桔梗皂苷D3含量分别增加21%、11%、17%；总皂苷含量分别增加19%、7%、11%。

图5 各处理间桔梗皂苷含量变化Fig. 5 Variations of platycodin content in different treatments

双因素方差分析结果（表4）表明，磷水平和AM真菌均对桔梗皂苷D、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、去芹糖桔梗皂苷D3、总皂苷有显著影响（P＜0.05）；且二者对桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、去芹糖桔梗皂苷D3、总皂苷有显著交互作用（P＜0.05），对桔梗皂苷D无显著交互作用（P＞0.05）。

表4 磷水平和AM真菌对桔梗皂苷的双因素方差分析Table 4 Two-way ANOVA of phosphorus level and AMF on platycodin

3 讨论

AM真菌能否在植物根系成功定殖是其与植物共生的基础，因此侵染率成为衡量植物根系与真菌共生情况的一个重要指标［9］。本研究表明，土著AM真菌对桔梗也存在一定程度的侵染，其侵染率最高可达21.3%。接种AM真菌后，在P2水平时，菌根侵染率、侵染强度、孢子数比P0水平时显著增加，当达到P3水平时菌根侵染率降低，由此表明，适宜磷水平可以促进AM真菌侵染植物根系，过高或过低磷水平均不利于AM真菌侵染。研究证实，当土壤速效磷含量较高时，植物体内的磷含量也会变高，使得其根部细胞膜的渗透性降低，导致根系分泌物减少，而这会使AM真菌大大减少与根系形成二次侵入的机会，进而降低了AM真菌侵染率［10］，当土壤速效磷含量较低时，一方面桔梗生长发育需要磷，另一方面AM真菌的生长发育也需要一部分磷。当土壤磷含量无法同时满足两方面的需求时，AM真

菌的生长就受到一定水平的抑制，导致其侵染率较低。此外，在同一磷水平时，FM侵染率、侵染强度、孢子数均高于另外两个菌种，表明其在栽培桔梗中比另外两个菌种更具应用潜力。因此要将AM真菌的接种效应发挥到最大化，应该筛选适合宿主植物的AM真菌种类，并确定其最适磷水平，以确保菌根共生体生长状况达到最优，更大程度地提高AM真菌的促生作用。

植物在遭受某些逆境胁迫时，会使SOD、POD等保护酶的活性大幅升高，迅速清除活性氧［11］。本研究表明，在P0和P3水平时，接种植株SOD、POD活性显著高于未接种植株，说明植物在低磷和高磷条件时，会增加体内保护酶来抵抗不良环境的影响，而接种AM真菌可以提高保护酶的活性，保护植物免受伤害，这与杨国等［12］研究结果一致。此外，在同一磷水平下，FM、DE及RI三种菌种均可提高SOD、POD活性，且FM提升效果优于DE和RI。在适宜磷水平时，接种AM真菌后能显著提高桔梗SOD、POD活性，说明接种AM真菌可以提高桔梗抵抗逆境的能力，这可能是AM真菌提高桔梗活性氧清除能力，加快清除氧自由基的结果。此外，植物还可通过渗透调节来增强自身抗逆性［13］。本研究发现，P0和P3水平时，接种与未接种植株可溶性糖、可溶性蛋白含量降低，而脯氨酸和丙二醛含量升高，这与滕华容等［14］研究结果相似。接种AM真菌后，桔梗植株可溶性糖、可溶性蛋白的含量显著高于未接种植株，脯氨酸含量显著低于未接种植株，说明接种AM真菌通过增强植物对水分的吸收，缓解植物受到不良环境的胁迫，进而增强植物抗逆性，与赵金莉等［15］研究结果一致，AM真菌可以通过调控植物体内渗透调节物质，进而帮助机体抵御逆境，增强其环境适应性。本试验结果认为FM比RI和DE更有利于桔梗可溶性蛋白和可溶性糖的提高，但齐国辉等［16］认为RI比FM更有利于植株可溶性蛋白的形成，这可能是因为AM真菌对宿主植物某些指标的促进作用并不只受菌种的影响，还与宿主植物的种类、管理条件、培养基质等条件有关。

在不同土壤磷水平下，接种 AM 真菌能缓解磷限制并促进幼苗生长［17］。本研究结果表明，接种同一菌种后，P1、P2、P3水平的根鲜重显著高于P0水平，且P2水平时达到最高。在同一磷水平接种3种AM真菌后的根鲜重显著高于未接种桔梗，3种AM真菌的根鲜重差异不显著。说明在适宜磷水平接种AM真菌可以促进桔梗生长提高其生物量。AM真菌可通过与植物共生引起的代谢变化来影响药用植物有效成分含量［18］。本研究发现，接种FM后的植株桔梗皂苷含量显著高于接种RI、DE及未接种植株，说明FM菌种较RI和DE菌种更具优势。有学者认为［19］，植物次生代谢产物是植物面对外界环境刺激时做出的防御性反应。接种AM真菌后桔梗皂苷含量显著提升，推测可能是桔梗将AM真菌作为外界环境的刺激而产生的系统防御应答，这与前人的研究结果一致［20］。同时，各处理在P2水平下，桔梗皂苷含量达到最高，说明磷水平过高或过低都会影响桔梗皂苷含量。磷水平过低，不能满足桔梗和AM真菌的生长需求，使菌根共生体生长受到极大限制；当磷水平过高时，桔梗自身吸收的养分足以维持自身各种代谢，AM真菌的效果就不显著［21］，另一方面过高的磷水平使AM真菌的生长和代谢活性下降，导致菌根共生体吸收养分受到一定的限制［19］，进而使桔梗皂苷合成受阻。适宜磷水平接种AM真菌可以诱导桔梗次生代谢过程的变化，更有利于桔梗皂苷的积累。

4 结论

FM、RI和DE均可与桔梗共生，不同磷水平接种不同AM真菌在促进桔梗生长、增强桔梗抗逆性、提高桔梗皂苷积累等方面存在不同程度的差异，综合分析在80 mg/kg磷水平时，接种AM真菌效果最好，且FM优于RI和DE。