小鼠肠道3型固有淋巴样细胞检测与分析方法研究

余 利，蒋 玲，周 杰，候鹏飞，糜漫天，易 龙

(陆军军医大学军事预防医学系军队营养与食品卫生学教研室/重庆市医学营养研究中心/重庆市营养与食品安全重点实验室，重庆 400038)

肠黏膜免疫组织是机体免疫系统的重要组成部分。肠腔中大量的食物抗原、代谢产物、微生物等给肠黏膜中的各种免疫细胞提供了非常特殊的微环境，免疫细胞与微生物相互共进化而达到平衡。当这种平衡被破坏时，往往会发生炎症或感染。肠黏膜上皮及固有层中有许多不同种类的免疫细胞，固有淋巴样细胞(innate lymphoid cells，ILCs)是一类新近定义的细胞家族，在快速启动早期免疫反应限制病原体入侵、促进组织修复以及调节抗原特异性免疫反应中发挥重要作用。ILCs是一类异质性免疫细胞群，属淋巴细胞家族成员，由共同淋巴祖细胞(common lymphoid progenitor，CLP)分化而成，其既不属于传统的T细胞、B细胞，也缺乏抗原特异性受体TCR和BCR，但却能介导获得性免疫相关功能，因此成为了固有免疫与获得性免疫之间的“桥梁”。根据细胞表型、分泌细胞因子及其分化所依赖的不同转录因子，ILCs可分为1型固有淋巴样细胞(group 1 innate lymphoid cells，ILC1)、2型固有淋巴样细胞(group 2 innate lymphoid cells，ILC2)、3型固有淋巴样细胞(group 3 innate lymphoid cells，ILC3)和调节型固有淋巴样细胞(regulatory innate lymphoid cells，ILCreg)四类。其中，ILC3主要分布在肠黏膜固有层中，在维持肠道稳态、抵御外界病原体、维护肠道屏障功能方面具有重要作用[1-4]，与2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝病等慢性疾病及炎症性结肠炎等的发生密切相关[5-6]，因此其成为了近年来免疫学领域研究的新热点。但是，肠黏膜固有层ILC3的检测和分析存在较多技术难点，本研究在借鉴国内外相关研究的基础上，针对小鼠小肠和结肠组织消化、固有层淋巴细胞多标记物共标和流式细胞术检测、ILC3的IL-22表达分析等环节，建立了一套成熟可行的检测和分析方法，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性C57BL/6小鼠10只，体质量20～25 g，购自陆军军医大学实验动物中心，普通饲料常规喂养，实验前12 h禁食。

1.1.2 主要试剂 胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、RPMI 1640培养基购自美国Hyclone公司；磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)购自中杉金桥公司；Hanks和D-Hanks平衡盐溶液购自碧云天生物公司；小鼠重组IL-23蛋白购自R&D Systems公司；β-巯基乙醇购自Sigma-Aldrich公司；布雷非德菌素A和莫能霉素购自BD Bioscience公司；青霉素/链霉素(penicillin-streptomycin，P/S)混合溶液购自碧云天生物公司；乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)、羟乙基哌嗪乙硫磺酸(N-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethane-sulphonicacid，HEPES)和DNA聚合酶Ⅰ(DNase Ⅰ)购自上海生工生物公司；Percoll密度梯度离心分离液购自美国GE Healthcare公司；胶原酶D和分散酶购自瑞士Roche公司；固定/破膜试剂盒购自美国BD Bioscience公司、foxp3/转录因子染色试剂盒购自美国eBioscience公司；大鼠抗小鼠CD45 APC-CY7、CD3 FITC、CD90.2 PE-CY7、RORγt PE及IL-22 PerCP eFluor710均购自美国BD Bioscience公司，以上抗体工作浓度均为1∶100。

1.2 主要仪器

流式细胞仪(BD FCSverse，BD Biosciences公司，美国)、高速低温离心机(Beckman Coulter，德国)、台式低速水平离心机(L530，Cence湘仪离心机仪器有限公司，中国)、THZ-C恒温振荡器(江苏太仓实验设备厂，中国)、电子天平(METTLER TOLEDO，瑞士)。

1.3 实验方法

1.3.1 试剂配制 小肠预消化液：D-Hanks平衡盐溶液中加入1 mmol/L DTT、5 mmol/L EDTA、10 mmol/L HEPES、5%FBS，充分混匀，以0.22 μm过滤器过滤后置于37 ℃孵箱中备用，每只小鼠需要约20 mL。小肠消化液：Hanks平衡盐溶液中加入0.5 mg/mLⅡ型胶原酶、100 μg/mL DNase Ⅰ、10% FBS，充分混匀，以0.22 μm 过滤器过滤后置于37 ℃孵箱中备用，每只小鼠需要约10 mL。小肠密度梯度离心液：首先配制含2%FBS的RPMI 1640培养基，用该溶液和Percoll密度梯度离心分离液混合制成30% Percoll工作液，置于室温备用，每只小鼠需要约10 mL。结肠预消化液：D-Hanks平衡盐溶液中分别加入10 mmol/L HEPES和5 mmol/L EDTA，充分混匀，每只小鼠需要约10 mL。结肠消化液：Hanks平衡盐溶液中分别加入500 μg/mL胶原酶D、500 μg/mL DNase Ⅰ、0.5 U/mL分散酶和2%FBS，充分混匀，每只小鼠需要约15 mL。Percoll工作液：首先用10×PBS与Percoll密度梯度离心分离液按照1∶9的体积比混合，制备100% Percoll，再与1×PBS按不同的体积比混合可得到不同浓度的Percoll工作液。IL-22检测细胞刺激培养液：在RPMI 1640培养基中分别加入50 ng/mL IL-23、55 nmol/L β-巯基乙醇、20% FBS、2%青霉素—链霉素溶液、布雷非德菌素A(1∶1 000)和莫能霉素(1∶1 500)，充分混匀。

1.3.2 小肠及结肠组织分离和前处理 肠组织分离：小鼠用5%水合氯醛麻醉后固定在手术板上，用75%乙醇消毒腹部，“工”形打开腹膜，剪开小肠与胃结合部，用镊子游离小鼠肠道组织，从回盲部完全分离小肠，切除盲肠后，在近直肠处完全分离结肠组织。肠组织前处理：将小肠和结肠组织分别置于4 ℃预冷的PBS中，去除肠系膜、脂肪组织和小肠Peyer’s淋巴结(可通过其不透明的颜色和节点结构来识别)，沿肠道长轴剪开肠组织，在预冷的PBS中洗涤2次，除去粪便和黏液。

1.3.3 小肠和结肠固有层淋巴细胞分离 小肠固有层淋巴细胞分离：将小肠转入50 mL无菌EP管中，每管加入20 mL小肠预消化液，37 ℃、210 r/min震荡20 min，连续消化2次，涡旋后弃上清。用Hanks平衡盐溶液漂洗组织2次，加入10 mL小肠消化液，37 ℃、210 r/min震荡30 min，连续消化3次，收集每次的消化液，用70 μm细胞筛过滤到50 mL无菌EP管中，4 ℃、2 000 r/min离心10 min，重悬并合并细胞沉淀。每个样本用10 mL 30% Percoll工作液，2 000 r/min离心10 min，弃上清，保留细胞沉淀，1×PBS洗涤1次，用含20% FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞。结肠固有层淋巴细胞分离：将结肠转入50 mL无菌EP管中，每管加入5 mL结肠预消化液，37 ℃、180 r/min震荡20 min，重复2次，涡旋后弃上清。立即将结肠转移到预冷的PBS中清洗，随后置于纸巾上轻拍，再用剪刀将结肠剪碎成约4 mm×4 mm的小块，然后转移到装有5 mL结肠消化液的50 mL无菌EP管中，37 ℃、210 r/min震荡20 min，重复消化3次，收集每次的消化液，用70 μm的细胞筛过滤到50 mL无菌EP管中，加入5 mL含2%FBS的RPMI 1640培养基，混匀后4 ℃、800×g离心10 min。每个样本用7 mL含2%FBS的RPMI 1640培养基重悬沉淀，加入3 mL 的100% Percoll工作液，涡旋15 s，充分混匀，1 300×g离心20 min，1×PBS洗涤1次，用含20% FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞。

1.3.4 ILC3染色和流式细胞术检测 取分离后的肠黏膜固有层淋巴细胞，加入PBS(1 mL/1.5 mL EP管)，混匀洗涤1次后，500×g离心5 min。弃上清，余约100 μL液体，涡旋细胞。加入流式检测表面抗体CD45 APC-CY7、CD3 FITC和CD90.2 PE-CY7各1 μL，4 ℃避光孵育30 min。加入1 mL PBS，混匀洗涤1次，500×g离心5 min，弃上清。加入1 mL 转录因子1×固定/破膜工作液，涡旋细胞，室温避光孵育30 min。700×g离心5 min，再加入1 mL的1×固定/破膜缓冲液，洗涤1次。以700×g离心5 min，余约100 μL液体，加入1 μL RORγt PE抗体，混匀，室温避光孵育30 min。加入PBS(1 mL/1.5 mL EP管)，混匀洗涤，700×g离心5 min。弃上清，用300 μL PBS重悬细胞，随后上机检测，利用FlowJo(10.0版本)软件分析。

1.3.5 ILC3表达IL-22的检测 取分离后的肠黏膜固有层淋巴细胞，用新鲜配制的IL-22检测细胞刺激培养液重悬后，加入到24孔细胞培养板中，置于37 ℃、5% CO2孵箱中刺激和孵育4 h，随后收集细胞进行染色，细胞固定/破膜后同时加入IL-22 PerCP eFluor710抗体，其余步骤同1.3.4，随后上机检测，利用FlowJo(10.0版本)软件分析。

2 结果

2.1 小鼠小肠和结肠固有层淋巴细胞分离

小肠和结肠ILC3的检测首先要获取小肠和结肠固有层淋巴细胞单细胞悬液，分离步骤见图1，总分离时间约3 h。

2.2 小鼠小肠和结肠固有层ILC3及IL-22表达检测

本研究采用CD45+CD3-CD90.2+RORγt+多标记物共标的流式分析策略检测小肠和结肠ILC3(图2a)，同时固有层淋巴细胞分离后体外刺激4 h，利用胞内流式细胞术进一步检测ILC3表达IL-22的水平(图2b)，结果显示，在小肠和结肠中，ILC3在淋巴细胞中的占比分别为(8.30±2.42)%和(1.43±0.34)%，IL-22+ILC3在RORγt+ILC3中的占比分别为(38.98±8.76)%和(85.86±1.72)%，见图2c、d。

a：打开小鼠腹腔；b：分离小肠和结肠组织；c：去除肠系膜和脂肪组织；d：去除小肠和结肠内容物；e：待消化的小肠和结肠；f：将分离干净的小肠和结肠组织置于预冷的PBS中；g：分别加入小肠和结肠预消化液；h：于37 ℃摇床中消化；i、j：将组织用Hanks平衡盐溶液洗涤后加入消化液；k：过滤消化液；l：Percoll工作液纯化细胞

a：小肠和结肠固有层ILC3检测；b：胞内流式细胞术检测ILC3表达IL-22的水平;c、d：小肠和结肠固有层ILC3比例及IL-22表达水平

3 讨论

免疫学的发展让我们逐渐认识到，疾病高发组织器官(如肝、肠、肺、脑等)由于具有独特的结构、功能和组织微环境，形成了独特的区域免疫特性，一些重要免疫细胞群、免疫分子在疾病的发生发展中起着关键作用[7-8]。肠道既是机体吸收营养的主要器官，也是机体最大的黏膜免疫器官，是抵御病原体入侵的重要防线，肠道屏障对维持肠道局部及机体的稳态有着重要作用。ILCs是机体固有免疫的重要组成部分，在启动早期反应清除病原体入侵和感染、黏膜稳态维持、组织修复中发挥重要作用。ILCs的四个亚型ILC1、ILC2、ILC3和ILCreg[9]分别与辅助性T细胞1(Th1)、辅助性T细胞2(Th2)、辅助性T细胞17(Th17)和调节性T细胞(Treg)互为“镜像细胞”。其中，ILC3几乎全部分布于胃肠黏膜固有层中，是维持肠黏膜固有免疫及屏障功能的关键效应细胞。

肠道稳态是肠黏膜屏障、肠道菌群、营养代谢物质等相互作用形成的动态平衡状态[10]。作为在生理状态下肠黏膜组织中分布较广泛的ILCs亚群，ILC3主要通过分泌IL-22、IL-17、GM-CSF等细胞因子对抗致病菌，诱导机体对共生菌群及食物抗原的免疫耐受，并促进肠黏膜损伤修复，从而维持肠道稳态。IL-22是ILC3分泌的主要效应细胞因子，属于IL-10家族，主要由NCR+ILC3分泌，在稳态下可被黏附于肠上皮的共生菌群诱导产生，是维持肠道稳态的重要细胞因子。ILC3能够产生IL-22作用于肠上皮细胞的异二聚体受体IL-22R1、IL-22R2，激活信号转导与转录激活因子3和核苷酸结合寡聚化结构域2信号通路，使其分泌Muc1、Muc3、Muc10和Muc13等黏蛋白及RegⅢβ、RegⅢγ等抗菌肽以对抗致病菌，限制共生菌与上皮细胞的接触，避免产生肠道炎症[11]。此外，ILC3还可以通过分泌IL-17发挥促炎作用，诱导炎症性肠病的发生[12]。因此，ILC3与肠道屏障功能、多种肠道相关疾病的发生密切相关。ILC3以表达转录因子RORγt为特征，RORγt与ILC3的存活、分化和免疫功能密切相关，能够通过ROR反应元件介导IL-22表达。

原代分离肠ILCs及检测ILC3的数量和功能对于开展实验研究十分重要，但是肠ILCs的分离和ILC3的检测存在一些技术难点，且国内外不同实验室在方法上亦不统一。首先，小鼠肠黏膜固有层存在大量胶原纤维，且小肠和结肠组织中胶原纤维种类差异较大，因此选择合适的胶原酶进行消化是关键；其次，分离时间的长短与细胞活力密切相关，因此探索最优化的分离方法，缩短分离时间尤为关键；此外，由于ILC3的检测需采用多个标记物共标并通过多色流式细胞术进行，但既往ILC3细胞表面标志物和分析策略在国际上尚未完全统一，因此探索公认且便捷的表面标志物至关重要。

目前，关于肠ILCs的分离和ILC3的检测，国内外多个实验室先后建立了一些初步方法，但不同实验方法都存在一定局限性，且不同实验室之间的方法也存在一定差异。本实验室结合国内外相关研究，进一步探索和优化了ILCs分离和ILC3检测的实验条件，取得了较好的效果。本研究主要的技术特点和创新包括以下三个方面：①建立了有效去除肠系膜淋巴组织、Peyer’s淋巴结及肠上皮间淋巴细胞的方法，可避免其对固有层淋巴细胞的干扰。先机械分离肠系膜和脂肪组织，再识别小肠组织的Peyer’s淋巴结并予以去除，最后利用EDTA-DTT法将上皮层与固有层充分分离，实验结果提示，该方法基本排除了肠道其他淋巴细胞的影响，保证了固有层淋巴细胞的纯度。②建立了分别针对小肠和结肠胶原纤维的消化方法。对于小肠组织，本研究利用0.5 mg/mL Ⅱ型胶原酶消化3次的方法。由于Ⅱ型胶原酶含有更高的梭菌蛋白酶活性，有利于水解小肠固有层组织中具有三股超螺旋结构的天然胶原纤维，可充分分离小肠固有层淋巴细胞，同时加入100 μg/mL DNase I，可防止细胞死亡后释放大量的DNA导致细胞粘连，从而有效地分离出固有层单细胞悬液。对于结肠组织，本研究采用500 μg/mL胶原酶D和0.5 U/mL分散酶进行消化。胶原酶D有较低的胶原酶活性和极低的胰蛋白酶活性，能在水解胶原纤维的同时最大程度地保护细胞蛋白的完整性。分散酶也称中性蛋白酶，是一种非特异性的金属蛋白酶，可以有效水解Ⅳ型胶原纤维和纤连蛋白，适合结肠组织固有层淋巴细胞的消化分离，加入适量的DNase I后同样也可防止细胞粘连，从而有效地分离出固有层淋巴细胞单细胞悬液。但是，针对不同研究目的、实验动物和干预因素，不同实验中所采用的消化酶存在很大差异，如Wang等[13]在分离肠道固有层ILCs时选用的是Ⅱ型和Ⅲ型胶原酶，Chun等[14]则是采用胶原酶D消化分离结肠固有层ILCs，而在Dutton等[15]、Melo-Gonzalez等[16]和Zhou等[17]的研究中均采用Ⅷ型胶原酶进行小肠ILCs的消化分离。本研究所建立的方法适用于24周(6月龄)的C57BL/6小鼠，该年龄的小鼠肠道结缔组织较多，消化较困难。因此，根据不同情况选择合适的胶原酶以及消化时间，能够有效分离更多数量和有活性的ILCs。③建立了基于多种标志物的ILC3流式细胞术检测方法。ILC3自发现以来，其检测标志物随着认识的不断深入和免疫学技术的发展而不断变化，如CD45+Lin-CD127+RORγt+、CD45+Lineage-Thy1+RORγt+、CD45+Lin-CD127+CD90+RORγt+Tbet+/-等[18]。由于RORγt为核内转录因子，无法实现活细胞染色。近年来随着研究发展，为了实现ILC3的分选，CD45lowThy1.2high、CD45+Lin-CD90.2+NK1.1-NKp46+/-KLRG1-等分选策略也相继被公认，其中固有淋巴细胞为辅助性T细胞的镜像细胞，因此也常用CD3-代替Lineage-的标志物对ILC3进行标记[19]。本研究采用流式分析策略检测小肠和结肠ILC3，结果显示，此方法可成功分离小肠和结肠中的ILC3细胞，且小肠中ILC3细胞数比结肠中多，与国外同类研究基本一致[20-22]。

综上，本研究建立了一种小肠和结肠固有层ILC3检测和分析的方法，应用不同消化液分别消化小肠和结肠固有层淋巴细胞，进而通过多色流式细胞术检测ILC3及IL-22的表达，方法稳定可靠，重复性较好，为研究小肠和结肠ILC3打下了良好的基础。此外，由于肠黏膜固有层中还存在大量其他淋巴细胞亚群，本研究所建立的肠黏膜固有层淋巴细胞分离和ILC3的检测方法，也可为肠黏膜其他淋巴细胞如肠上皮间淋巴细胞、固有层T淋巴细胞、B淋巴细胞等的检测分析提供借鉴和参考。