臭氧预处理对老年兔心脏再灌注心律失常的影响及其作用机制

王芮 黄浦茜丹 张雨 关圆 张东亚

(1清华大学临床医学院，北京 100084；2解放军总医院第一医学中心麻醉科；3清华大学第一附属医院麻醉科)

冠心病是临床老年患者最为常见的一种心脑血管类疾病，体外循环下行冠脉搭桥手术是目前一种比较成熟的治疗方式，但是体外循环导致的心脏功能障碍严重影响患者的预后。心肌缺血-再灌注损伤(MIRI)是体外循环过程中发生心脏功能障碍的主要原因，严重的室性心律失常是MIRI的重要表现〔1〕。研究表明引起再灌注损伤的重要生理基础是炎症反应和氧化应激〔2〕，臭氧(O3)是一种活性氧，适量的臭氧处理有利于维持机体内氧化还原平衡状态，从而对发生MIRI的脏器产生保护作用〔3〕。但O3预处理是否可以降低再灌注心律失常(RA)的发生及其作用机制尚不清楚，本研究在老年兔离体心脏缺血-再灌注模型的基础上研究O3预处理对再灌注心律失常的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1仪器和试剂 Langendorff离体心脏灌流系统(成都仪器厂)，臭氧机(德国卡特公司)，氯化三苯基四氮唑(TTC，北京诺博莱德公司)，IL-6、IL-10试剂盒(上海酶联公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2实验动物 本实验已获得清华大学第一附属医院伦理审核委员会批准(批件号：RECLA18-01)。健康老年新西兰白兔(30月龄)，雌雄不拘(由清华大学第一附属医院动物实验室提供)。

1.3实验方法

1.3.1实验分组和预处理 24只老年新西兰白兔随机分为正常对照(C)组，缺血-再灌注(IR)组，O3预处理(O3P)组。C组和IR组术前5 d，常规饲养。O3P组术前5 d，每天上午9：00～11：00腹腔注射40 μg/ml O310 ml。

1.3.2Langendroff离体心脏灌注模型制备 术前30 min经兔耳缘静脉注射肝素400 IU/kg。耳缘静脉注射2.3%戊巴比妥钠注射液30 mg/kg实施麻醉，经肋弓下角切口至胸骨角暴露心脏，用显微手术镊夹于主动脉弓三大分支根部，迅速离断主动脉、肺动静脉和上下腔静脉。离断血管后，立即将心脏置于4℃的K-H灌注液(NaCl：13.84 g，NaHCO34.2 g，KCl 0.70 g，KH2PO40.32 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，葡萄糖4.0 g，CaCl20.40 g，蒸馏水 2 000 ml，pH 7.35～7.45)中，使其停搏以减少心肌缺血损伤并挤出离体心脏内残留的血液。迅速将主动脉根部悬挂于Langendorff灌注装置上，用K-H灌注夜(95%O2-5%CO2混合气体预充饱和)灌流，灌注温度37℃，灌注压80 mmHg。剪开左心耳，将与压力换能器连接的自制乳胶球囊经切开处置入左室，调节球囊内液体量，使左室舒张末压(LVEDP)维持在0～10 mmHg。将三个电极针分别置于心尖、左心耳、主动脉弓处的心外膜上，记录心电图〔4〕。

1.3.3全MIRI模型 在离体兔心脏恒流逆行灌注的基础上，用95%O2和5%CO2混合气体饱和后的K-H灌注液平衡灌注后，关闭蠕动泵停止灌注即为全心缺血，打开蠕动泵灌注即为恢复再灌注〔5〕。本实验兔心脏均进行平衡20 min，缺血30 min，再灌注60 min。

1.3.4心脏血流动力学和心电图指标监测 于平衡20 min(T0)、再灌注60 min(T1)时记录左室收缩峰压(LVSP)和LVEDP。计算左室舒张压(LVDP)=LVSP-LVEDP。记录各组离体家兔心脏再灌注期间室性心律失常(包括室性心动过速和心室颤动)的发生率和持续时间，图示为实验过程中的记录的心电图(图1)。心律失常评分采用Curtis-Walker评分标准〔6〕：0分为室性早搏0～49次、1分为室性早搏50～499次、2分为室性早搏>500次和(或)1次可恢复性室性心动过速和(或)室颤、3分为超过1次的可恢复性室性心动过速和(或)心室颤动(持续时间<60 s)、4分为室性心动过速和(或)心室颤动(总持续时间60～119 s)、5分为室性心动过速和(或)心室颤动(总持续时间>119 s)、6分为再灌注15 min后出现致死性心室颤动、7分为再灌注4～14 min 59 s后出现致死性心室颤动、8分为再灌注1～13 min 59 s后出现致死性心室颤动、9分为再灌注1 min内后出现致死性心室颤动。

a.正常窦性心电图；b.室早二联律；c.室速；d.室颤图1 心电图

1.3.5冠脉流出液IL-6、IL-10检测 于T0、T1取冠脉流出液(从腔静脉、肺动脉断端流出)放于1.5 ml离心管内，用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测流出液中IL-6、IL-10的浓度，按试剂盒要求进行。

1.3.6心肌梗死面积测算 再灌注结束后，每组随机选取四个心脏，剪去心房及动脉，滤纸吸干。置于-20℃冻存30 min，然后平行于房室沟将心脏切为1 mm的薄片，浸泡于1%TTC溶液中〔pH7.4，由磷酸盐缓冲液(PBS)配成〕避光保存，37℃恒温水浴20 min，梗死区为灰白色，非梗死区为砖红色。数码相机拍照，Image J软件分析心肌梗死面积(IS)。IS=(灰白色区面积/总面积)×100%。

1.3.7MDA和SOD的检测 再灌注结束后，取每组剩余的4个离体心脏，剪碎，研磨匀浆，经3 000 r/min 4℃离心15 min后取上清液，遵照试剂盒步骤处理后通过紫外-可见分光光度计测定SOD活性及MDA含量。

1.4统计学分析 采用SPSS23.0软件进行方差分析、Kruskal-WallisH秩和检验、χ2检验或Fisher确切概率法。

2 结 果

2.1各组血流动力学的比较 与T0时比较，IR组、O3P组T1时HR明显减慢，LVDP明显降低(P<0.05)。T1时，C组HR明显快于IR组和O3P组(P<0.05)，LVDP明显高于IR组、O3P组(P<0.05)；O3P组HR明显快于IR组(P<0.05)，LVDP明显高于IR组(P<0.05)。见表1。

表1 3组在不同时间点血流动力学参数比较

2.2各组RA比较 正常对照组灌注过程中除偶发室性早博(<49次)外未见其他RA，故不进行RA评分。与IR组相比，O3P组室颤时程缩短，室速发生率和室颤发生率减少，RA评分降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组家兔再灌注心律失常比较(n=8)

2.3各组炎症因子比较 与T0时比较，IR组和O3P组T1时IL-6、IL-10浓度均明显升高(P<0.05)。T1时，C组IL-6、IL-10浓度明显低于IR组和O3P组(P<0.05)；O3P组IL-6浓度明显低于IR组(P<0.05)，IL-10浓度明显高于IR组(P<0.05)。见表3。

表3 3组在不同时间点炎症因子比较

2.4各组MDA和SOD比较 与C组相比，IR组和O3P组MDA浓度明显增高，SOD浓度明显降低(均P<0.05)；与IR组相比，O3P组MDA浓度明显降低，SOD浓度明显增高(均P<0.05)。见表4。

表4 各组MDA、SOD浓度比较

2.5各组心肌梗死面积比较 C组心肌梗死面积百分比为(0.0±0.0)%、IR组为(16.2±5.0)%、O3P组为(8.0±1.0)%。与C组相比，IR组和O3P组心肌梗死面积均明显增加(P<0.05)。与IR组相比，O3P组心肌梗死面积明显减小(P<0.05)。

3 讨 论

心肌缺血后再灌注会引起RA，常表现为室性心律失常〔1〕。随着生活水平的提高，人口老龄化的进展及心脏外科技术的发展，进行体外循环下冠脉搭桥术的老年患者越来越多，而术后由于再灌注损伤导致的患者心律失常，严重影响患者的预后〔7〕。目前研究认为交感神经过度激活和炎症反应是心肌缺血再灌注诱发室性心律失常的两个主要因素〔8，9〕。O3是氧气的同素异形体，在常温下，它是一种有特殊臭味的淡蓝色气体。O3氧化能力极强，其氧化还原电位仅次于氟，比氧气更易溶于水。现有的研究提示O3可以通过减轻炎症反应发挥对缺血再灌注脏器的保护作用〔10〕。

心肌缺血后再灌注会引起心脏收缩功能降低〔11〕，LVDP、HR是衡量心脏收缩功能的重要指标。本研究表明心脏发生了再灌注损伤，提示兔离体心肌缺血-再灌注模型制备成功。本研究表明O3预处理改善了心脏收缩功能。心肌缺血再灌注后存活心肌的多少对心脏功能的恢复具有重要意义，普遍认为TTC染色检测存活心肌结果准确可靠，可作为识别梗死心肌和存活心肌的标准方法〔12〕。本研究表明O3预处理减轻了兔离体MIRI，进一步显示出O3预处理的心肌保护作用。

RA是MIRI后的特征性表现。严重的再灌注心律失常如室速或室颤，可影响心脏的灌注，进一步加重MIRI。本研究结果表明O3预处理能减少再灌注期间室速的发生率，减少室颤的发生率和发作时程，降低RA评分，提示O3预处理对可以改善RA发生及发作。

炎症反应在RA中发挥着重要作用〔9〕，心脏缺血后再灌注使血管内皮细胞及中性粒细胞产生IL-6等细胞因子、黏附因子，并释放如血小板刺激因子等炎性介质，这些炎性介质使得血管通透性增加，引发水肿，并损伤心肌细胞，使得细胞膜通透性增加，造成钙超载，引起心律失常〔2〕。IL-10是机体内重要的抗炎因子，主要由Th2细胞产生，可以抑制炎症因子的合成与释放，具有减轻炎症反应的作用，研究发现，在心肌缺血再灌注时IL-10通过抑制TNF-α RNA的表达和细胞间黏附分子的激活，来下调炎症反应，从而减轻MIRI〔13,14〕。现有研究认为炎症反应在心肌缺血-再灌注过程中参与RA形成，减轻外周和中枢炎症反应可能是降低RA发生率的一种治疗方法。O3可以与多不饱和脂肪酸等抗氧化剂及各种过氧化物发生反应从而调节炎症反应〔3〕，但O3预处理是否可以改善RA发生尚不清楚。本研究结果表明缺血后再灌注会导致心肌损伤。本研究还提示O3预处理可以抑制炎症因子的释放并且促进抗炎因子的表达，减轻炎症反应，从而发挥对MIRI的保护作用，降低RA发生。

氧化应激反应在RA中也发挥着重要的作用，缺血-再灌注期间，氧自由基生成增多但清除减少，破坏心肌细胞膜完整性，使其通透性增加，影响细胞膜上Na+-K+泵的功能，心肌细胞的应激性和自律性增高，易于形成折返，发生RA。体内氧自由基过剩是导致机体氧化应激损伤的根本原因，正常生理状态下，体内的氧自由基可以被SOD等抗氧酶清除，机体处在一种氧化还原平衡状态。但是当心脏发生缺血-再灌注后，氧化平衡被打破，过剩的氧自由基会攻击细胞膜，产生MDA等产物，因此SOD活性和MDA含量可直接和间接反映机体氧化应激损伤程度〔15〕。已有研究发现适量的O3预处理可以增加机体抗氧化能力，从而发挥对MIRI的保护作用〔16〕，但是关于其能否减少RA发生尚未有研究。本研究发现O3预处理可以减少MDA的产生，增加SOD的活性，减轻心脏的氧化应激损伤，从而改善RA发生。

本研究的不足之处在于选择离体心脏模型，未涉及整体神经-体液调节的研究，并且未对O3预处理降低RA发生的机制进行深入研究，未对炎症反应和氧化应激的上下游关键调控因子进行研究，下一步将进一步研究其保护作用的具体机制。

综上，O3预处理能够改善老年兔缺血-再灌注后心肌的收缩力，显著减少RA发生，其作用可能与减轻了炎症反应和氧化应激造成的心肌损伤有关。