miR-1285-3p在脑动脉瘤中对金属基质蛋白酶-13的作用

贾帅 丁新民

(山西医科大学附属人民医院神经外科，山西 太原 030000)

脑动脉瘤(CA)起源于颅内动脉血管壁部分区域的病理性膨胀〔1〕，是引发蛛网膜下腔出血的首要因素〔2〕，蛛网膜下腔出血发作时进展相当快，患者的致残率与致死率居高不下，患者的预后生活质量不高。对脑动脉瘤的病理学研究得知，该病的进展包括原有血管扩张、通透性增加、细胞外基质的降解、内皮细胞增生、迁移等多个过程，其中细胞外基质(ECM)降解是病程进展的关键一步〔3〕。基质金属蛋白酶(MMPs)分布在细胞外基质中，负责降解弹性蛋白、纤维蛋白、胶原蛋白与蛋白多糖等蛋白质〔4〕。在一些关于癌症的研究中已证实MMPs的异常表达与癌细胞的侵袭与迁移相关，而血管平滑肌细胞的迁移与胶原蛋白的降解极易诱发动脉瘤病程加速，并且对部分脑动脉瘤患者进行研究，其瘤壁组织与血浆中的MMPs表达水平比正常组织与血浆显著上调〔5〕。而有研究指出，miR-1285-3p可作为潜在的抑癌因子发挥抑癌作用〔6〕。本研究旨在探究miR-1285-3p在脑动脉瘤对MMP-13的调控作用与相互关系。

1 材料与方法

1.1一般资料 从2018年4月至2019年4月山西医科大学附属人民医院手术的脑动脉瘤患者中，随机选择17例患者作为研究组，其中男9例，女8例，年龄41～67岁，平均(56.27±7.19)岁，经数字减影响血管造影技术(DSA)确诊为脑动脉瘤，按瘤体直径对患者分类，小动脉瘤(直径<1.0 cm)11例，大动脉瘤(1.0≤直径<2.5 cm)5例，巨大动脉瘤(直径≥2.5 cm)1例〔7〕。依据病变部位对患者分类，颈内动脉瘤3例，前交通动脉瘤4例，大脑中动脉瘤6例，后交通动脉动脉瘤4例〔8〕。依据Hunt-Hess分级，Ⅰ、Ⅱ级患者12例，≥Ⅲ级患者5例〔9〕。另随机选择同期来山西医科大学附属医人民医院手术治疗的非血管性脑部疾病患者共19例作为对照组，其中脑外伤11例，脑肿瘤8例，收集其颞浅动脉组织。其中男8例，女11例，患者42～74岁，平均(58.25±6.94)岁。排除标准：既往有高血压和(或)高血脂病史者。入选患者知情并同意本研究内容。两组一般资料差异无统计学意义(P>0.05)，本研究经过医院伦理委员会批准。

1.2方法 对照组组织标本取自手术入路时经过的颞浅动脉。研究组组织标本取自术中夹闭动脉瘤后切除的部分瘤体组织。用焦碳酸二酯(DEPC)清洗组织表面的血液后，一部分组织放入锡纸做的样品槽中，应用最佳切割温度(OCT)将组织包埋后在液氮中冻存，低温切片，进行免疫组化与苏木素-伊红(HE)染色；另一部分组织用于提取收集组织中的总RNA与蛋白。

1.3组织总RNA的提取与RT-PCR检测 采用TRNzol试剂盒(tiangen公司，货号DP121221)提取总RNA。用nanodrop检测RNA A260/280值≥1.8时，用反转录试剂盒(tiangen公司，货号KR106)将去除gDNA的RNA反转录成cDNA，作为RT-PCR模板，应用SuperRealPreMix Plus(SYBR Green)(tiangen，FP205)试剂盒检测miR-1285-3p、MMP-13与MCP-1 mRNA的表达水平。使用2-ΔΔCt法对结果进行分析〔9〕。

1.4免疫组织化学的方法检测两组组织中MMP-13、CD68、细胞间黏附因子(ICAM)-1和NF-κB的表达水平 抗体均来自Abcam，货号ab39012、ab125212、ab2213、ab28856。将液氮冰冻好的组织块进行冰冻切片，切片在-20℃中冷冻一夜固定组织，-20℃丙酮固定10 min；洗第一次时，用磷酸盐缓冲液(PBS)反复浸湿几次，使温度平衡，PBS清洗3次，每次5 min；0.3% Triton X-100通透20 min；PBS清洗3次，每次5 min；3%H2O2浸泡20 min，去除内源性过氧化氢酶；PBS清洗3次，每次5 min；5%牛血清蛋白(BSA)室温封闭30 min；配制一抗工作液，4℃孵育过夜；PBS清洗3次，每次5 min；配制二抗工作液，室温孵育1 h；PBS清洗3次，每次5 min；室温下二氨基联苯胺(DAB)显色2～3 min，边染色、边镜检，正常显色后终止染色；自来水轻轻冲洗玻片，冲洗10 min；苏木精复染约20 s，之后用自来水冲洗10 min，终止染色；分化3 s；用75%、85%、95%、100%(2遍)酒精逐级脱水，每级5 min；用两级二甲苯透明，每级5 min；中性树胶封片，光学显微镜下观察染色结果；光学显微镜下观察拍照、记录。

1.5HE染色方法观察两组组织的血管形态 -20℃丙酮固定10 min，用PBS反复浸湿几次，使温度平衡，PBS清洗3次，每次5 min，苏木精染色30～60 s，之后用自来水冲洗，终止染色；伊红染色30～60 s，边染色边观察，之后用自来水冲洗，终止染色；用75%、85%、95%、100%酒精逐级脱水，每级5 min；用两级二甲苯透明，每级5 min；中性树胶封片，光学显微镜下观察染色结果；观察拍照、记录。

1.6Western印迹检测MMP-13与MCP-1蛋白的表达 MCP-1 抗体来自Abcam公司，货号ab9669。将组织块加入放射性免疫沉淀(RIPA)裂解液后磨碎，冰上静置30 min后以4℃、1 000 r /min的转速离心10 min，取上清。用酶标仪检测蛋白样品的浓度后，取适量蛋白，加入溴酚蓝与RIPA，煮沸7 min，将蛋白样品彻底变性，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。电泳结束后，将MMP-13与MCP-1蛋白与内参β-actin所在的条带切下并转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脱脂奶粉封闭90 min后，加入相应的一抗(抗体：脱脂奶粉=1∶2 000)孵育过夜。次日上午用1×TBST彻底洗涤过后再加入相应的二抗(抗体：脱脂奶粉=1∶5 000)，室温反应1 h，然后1×TBST洗涤，用ECL显色液显色。

1.7观察指标 免疫组化阳性表达的评定方法：当标记分子进入细胞质且能够看到棕黄色颗粒时，视为阳性表达，依据阳性细胞数比例和染色强度参考相关半定量评分标准：(1)依据阳性细胞所占比例区分：没有阳性细胞计0分；阳性细胞所占比例低于30%计1分；阳性细胞高于30%计2分。(2)依据着色情况区分：没有着色计0分；表现为淡黄色计1分；表现为棕黄色计2分；表现为棕褐色计3分。计算以上所得评分的乘积，若为0～1分，则为-；若为2～4分，则为+；若为5～6分，则为；其中阳性表示为+及〔9〕。

1.8统计学分析 采用SPSS18.0软件进行χ2检验、t检验。

2 结 果

2.1两组组织形态的观察 研究组瘤壁组织较对照组变薄且向外膨出，内皮细胞空泡状，部分内皮细胞脱落进入血管腔中游离，可见血栓形成，内膜弹力板变薄或突然间断，平滑肌数目显著降低，中膜和外膜有大量炎性细胞浸润，整个组织的动脉壁厚度不均一，局部区域显著变薄，见图1、2。

图1 对照组正常颞浅动脉组织HE染色(×200)

图2 研究组脑动脉瘤瘤壁组织HE染色(×400)

2.2两组组织中MMP-13、CD68、ICAM-1和NF-κB阳性表达水平对比 MMP-13、CD68在瘤壁组织中均有表达而ICAM-1和NF-κB主要表达在炎性细胞与血管内皮细胞中，研究组MMP-13、CD68、ICAM-1和NF-κB阳性表达水平均显著高于对照组(P<0.05)，见表1、图3。

表1 两组组织中MMP-13、CD68、ICAM-1和NF-κB阳性表达对比

图3 两组血管壁组织中MMP-13、CD68、ICAM-1、NF-κB阳性表达

2.3两组检测miR-1285-3p、MMP-13与MCP-1 mRNA及蛋白表达水平的对比 研究组miR-1285-3p mRNA表达水平显著低于对照组(P<0.05)，MMP-13、MCP-1 mRNA及蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05)，见表2、表3、图4、5。

表2 两组检测miR-1285-3p、MMP-13与MCP-1 mRNA表达水平的对比

表3 两组组织中MMP-13与MCP-1蛋白表达水平比较

图4 两组组织中MMP-13蛋白表达

图5 两组组织中MCP-1蛋白表达水平

3 讨 论

microRNA(miRNA)是一种真核生物细胞内源性的短RNA分子,长约20 bp。虽然miRNA不直接编码蛋白，但可以通过直接作用于靶mRNA，也可以与靶mRNA上3'端的非翻译区相互结合，以这两种方式来调控基因在转录后的水平〔12〕。

早年对CA的研究认为是血流不断冲击脑血管、中膜平滑肌层和弹力纤维受损引起疾病发生〔13〕，近些年更深层的研究发现，动脉瘤壁呈现平滑肌变形、炎性细胞浸润、ECM胶原纤维排列杂乱〔14〕。研究发现，动脉瘤瘤壁内所有的炎性细胞均过量分泌MMPs，破坏细胞ECM、弹性蛋白及胶原蛋白，破坏正常的血管结构〔15〕。正常生理状态下MMPs能降解所有已知细胞外基质组分，维持ECM动态平衡。本研究结果表明MMP-13分布在脑动脉血管的各层结构中。

MCP-1又称单核细胞趋化蛋白，催化单核细胞迁移并分化成巨噬细胞，在炎症反应中扮演重要角色〔16〕。本研究进一步验证了炎症反应促进了CA的发生。

在CA的发病机制研究中，认为颅内动脉的分支处由于血流的冲击等多种动力学因素易发生损伤，在多种机制的调控下，血管内皮受损处触发炎症反应，炎性细胞释放炎性因子与MMPs，破坏动脉基质，血管重构，动脉血管壁不再完整，瘤体膨出，CA发病〔17〕。CA患者组织中的低miR-1285-3p表达水平促进了MMP-13表达从而促进CA的发生，提示通过维持miR-1285-3p水平能够抑制MMP-13表达，为CA的治疗提供崭新的思路与实验基础。