沐耄舒药浴乳中药成分浸提液对角质细胞影响的研究

曾碧君，何勇，童许萍，张予，杨志波

（1.湖南省中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005；2.贵州朗佑堂制药有限公司，贵州 丹寨 557500）

皮肤是人体抵御多种外部病原体和环境危害的第一道防线，有重要的自我平衡功能，如减少水分流失和有助于身体温度调节。然而，随着年龄的增长，皮肤结构发生变化，表皮和真皮层变薄，水分流失增加，胶原蛋白和弹性蛋白碎裂[1]。老年人皮肤常出现干燥、菲薄、粗糙、皮下脂肪少，有鳞屑、角化等现象[2]。靶向皮肤的激素状态或其表面营养，可以减缓年龄引起的皮肤氧化，减缓老年人皮肤干燥、脱屑和瘙痒的症状，有助于修护皮肤屏障[3]。近年来文献报道，中药成份有抗老化及增加皮肤水分的作用[4]。开发以中草药为主要有效成分的药浴乳来延缓皮肤衰老，已成为皮肤保湿和抗氧化研究的新方向。沐耄舒是贵州朗佑堂制药有限公司生产的中老年人专用药浴乳，本研究拟采用人永生化表皮细胞（HaCaT）为研究对象，从皮肤保湿与屏障功能、抗氧化功能、角质细胞炎性等方面，探究沐耄舒药浴乳中药成分浸提液对角质细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 HaCaT 细胞株购自来源于中科院上海细胞库，复苏后应用。HaCaT 在含10%胎牛血清的DMEM 培养基中，于37 ℃、5%二氧化碳（CO2）条件下常规传代培养。

1.1.2 主要试剂 DMEM 培养基、胎牛血清和酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒均购自美国Thermo Fisher 公司；脂多糖（LPS）和干扰素-γ（IFN-γ）购自美国PeproTech 公司；RNAiso Plus、cDNA 第一合成试剂盒和实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）试剂盒购自日本TaKaRa 公司；qRT-PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成。水通道蛋白（Aquaporin 3）、丝聚合蛋白（Filaggrin）、兜甲蛋白（Loricrin）及内披蛋白（Involucrin）等本研究所用所有蛋白相应抗体均购自美国Thermo Fisher 公司。

1.2 方法

1.2.1 沐耄舒药浴乳中药成分浸提液的制备 沐耄舒药浴乳主要由人参、淫羊藿、墨旱莲、苦参、白鲜皮、地肤子、牡丹皮、玄参、当归、玉竹、麦冬、天冬、豨莶草、防风、土茯苓、槐枝、桑叶和薄荷组成。以上所有药物均由湖南中医药大学第一附属医院中药房提供，按《中华人民共和国药典》规定的有关工艺操作方法进行中药成分浸提液的制备，将18种药材分别按照沐耄舒药浴乳配方中的组成比例用沸水进行多次煎煮提取，合并药液后采用旋转蒸发仪将提取液进行浓缩，最终使浸提液浓度为每毫升相当于原药材1.0 g，分装，于4 ℃保存备用。

1.2.2 浸提液浓度筛选 HaCaT 细胞以5×103个/孔的密度铺种于96 板中，每孔约100 μL 细胞悬液，同一样本做3 个或以上复孔；将接种好的细胞放入细胞培养箱中培养24 h 使细胞完全贴壁；分别加入0、10、20、50 和100 mg/mL 的浸提液，然后分别于0 h、24 h 和48 h，每孔加入10 μL CCK8 试剂，混匀；37 ℃孵育2 h 后，测定450 nm 处的吸光度，根据OD 值进行组间的统计分析。

1.3 浸提液对角质细胞皮肤保湿与屏障功能的影响 按常规方法培养HaCaT 细胞并加入16 孔板，然后加入浸提液处理30 min，对照组加入对应量的磷酸盐缓冲溶液（PBS），收集细胞待用。①采用ELISA试剂盒检测细胞中透明质酸含量，具体方法参照试剂盒说明书。②提取RNA，以GAPDH 基因作为内参，采用qRT-PCR 检测透明质酸的合成酶HAS1，HAS2 和HAS3 的mRNA 表达水平。qRT-PCR 实验条件如下，53 ℃：2 min；95 ℃：10 min；95 ℃：15 s；60 ℃：1 min，共40 个循环。③采用Western blot 检测透明质酸的合成酶1（HAS1），HAS2 和HAS3 及皮肤保湿与屏障修复相关因子Aquaporin 3，Filaggrin，Loricrin 及Involucrin 蛋白表达水平。每组3 个重复。

1.4 浸提液对角质细胞抗氧化功能的影响 ①流式细胞术检测HaCaT 细胞内活性氧含量：以1×105/孔接种细胞于6 孔板内，设置实验分组为阴性对照PBS 组、H2O2（500 μmol/L，12 h）处理组、浸提液组及H2O2处理组+浸提液组。待药物刺激24 h 后，用无血清培养基稀释2'，7'-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA），使其终浓度为10 μmol/L，每孔加入1 mL DCFH-DA溶液。37 ℃避光孵育细胞20 min 后，移去培养基，PBS 漂洗3 次，然后离心收集细胞，利用流式细胞仪（激发光波长525 nm）对样本进行检测，每个样品检测1×104个细胞，Cell Quest 软件分析结果。实验过程需避光[5]。②采用氮蓝四唑（NBT）光化还原法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性[6]；采用高效液相色谱法（HPLC）法测定谷胱甘肽（GSH）含量[7]。③Western blot 检测抗氧化蛋白核因子红细胞相关因子-2（Nrf-2）、血红素氧合酶-1（HO-1）的蛋白表达水平。

1.5 浸提液对LPS/IFN-γ 诱导的角质细胞炎性的影响 以1×106个细胞/孔将收集的HaCaT 细胞铺于6 孔细胞培养板中，设置实验分组为PBS、LPS（1 μg/mL）/IFN-γ（50 ng/mL）、MMS、LPS/IFN-γ+MMS。HaCaT 在含10%胎牛血清的DMEM 培养基中，于37 ℃、5%CO2条件下常规传代培养，培养5 d后，LPS/IFN-γ 处理组加入1 μg/mL LPS 培养24 h或者50 ng/mL IFN-γ 培养48 h。收集诱导处理7 d后的细胞，提取RNA 并逆转录，用qRT-PCR 检测其中炎性因子白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α），环加氧酶2（PTGS2）的表达量。

2 结果

2.1 浸提液浓度筛选 为研究沐耄舒药浴乳中药成分浸提液（MMS）对角质细胞影响，采用不同浓度的MMS 分别处理角质细胞0 h、24 h、48 h，筛选适合角质细胞生长的沐耄舒药浴乳中药成分浸提液浓度。不同浓度及不同处理时间其对HaCaT 细胞增殖的影响，见图1。结果发现，不同浓度MMS 对角质细胞的增殖效果比较差异无统计学意义。

图1 不同浓度MMS 处理角质细胞的增殖情况

2.2 检测浸提液促进角质细胞皮肤保湿与屏障功能 MMS 处理后，HaCaT 细胞的透明质酸含量明显升高，见图2A。同时利用qRT-PCR 及Western blot检测透明质酸的合成酶HAS1，HAS2 和HAS3 的表达，发现MMS 处理后，透明质酸的合成酶HAS1，HAS2 和HAS3 的表达量明显增加，见图2B。进一步检测发现HaCaT 细胞中皮肤关键因子Aquaporin 3，Filaggrin，Loricrin 及Involucrin 表达量明显增加，见图2C、D，这4 个因子在机体维持水代谢、角质化被膜形成及皮肤表皮角层屏障构成过程中有重要作用[8]。说明MMS 能够促进角质细胞皮肤保湿并增强其屏障功能。

图2 MMS 对HaCaT 细胞透明质酸含量及皮肤保湿及屏障功能相关因子表达水平的影响

2.3 浸提液促进角质细胞抗氧化功能 利用流式细胞术检测不同处理组HaCaT 细胞内的ROS 水平，结果发现与PBS 组相比，MMS 组证明MMS 能够明显减弱角质细胞ROS 含量；而H2O2能够显著诱导HaCaT 细胞内的ROS 含量。并且与H2O2处理后的HaCaT 细胞相比，H2O2+MMS 组证明MMS 能够明显清除H2O2处理角质细胞诱导增加的ROS 含量，见图3A，并增强角质细胞SOD 活性及GSH 含量，见图3B、C。进一步检测抗氧化相关因子Nrf2 和HO-1 的表达，发现MMS 处理后，Nrf-2 和HO-1 显著上调表达，见图3D。以上结果提示MMS 处理能够明显增强HaCaT 细胞的抗氧化功能。

图3 MMS 对HaCaT 细胞抗氧化功能的影响

2.4 浸提液对LPS/IFN-γ 诱导的角质细胞炎性的影响 设置PBS、LPS（1 μg/mL）、MMS、LPS+MMS 分别处理24 h 后，qRT-PCR 检测炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α、PTGS2 的表达，见图4。MMS 处理后IL-1β、IL-6、TNF-α 表达量明显降低，PTGS2 表达量显著升高。LPS 诱导角质细胞炎性反应后，MSS 处理也显著减弱炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的高表达，恢复PTGS2 的表达。进一步设置PBS、IFN-γ（50 ng/mL）、MMS、LPS+MMS 分别处理48 h 后，同样发现MMS 处理后IL-1β、IL-6、TNF-α 表达量明显降低，PTGS2 表达量显著升高。并且IFN-γ 诱导角质细胞免疫能力后，MSS 处理也显著减弱炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的高表达，恢复PTGS2 的表达。结果证明，MMS 处理后能够显著减弱LPS/IFN-γ诱导的细胞炎性反应及免疫反应。

图4 MMS 对LPS/IFN-γ 诱导的细胞炎性反应及免疫反应的影响

3 讨论

皮肤细胞的更新速度，会随着年龄的增长而减慢。有文献报道，年轻人的表皮细胞大约每21 天更新1 次，然而老年人却需要2 倍甚至更多的时间[9]。并且，老年人真皮会逐渐萎缩，厚度减少约20%，导致皮肤变得薄而透明，容易干燥和瘙痒。据统计，在65～75 岁的人群中，有约55%的人群患有严重的皮肤疾病[10]。因此，保持皮肤水分、修护皮肤屏障功能是预防老年人皮肤衰老和瘙痒的重要的途径。

皮肤老化及损伤涉及皮肤组织的各种生理变化，在老化的皮肤中，真皮细胞外基质的主要成分胶原纤维的降解，水通道蛋白（AQP3）和皮肤成分（如透明质酸和神经酰胺）的变化，造成皱纹和减少皮肤保湿，从而导致皮肤干燥和缺乏弹性[11]。因炎性反应增加会促进凋亡细胞的死亡，被认为是皮肤衰老及衰老相关疾病的主要致病因素之一[12]；此外，大量研究提出氧化损伤是皮肤衰老的一个重要原因[13]，ROS 能够通过影响机体内抗氧化酶如SOD 等的表达及GSH 水平，从而改变细胞内抗氧化系统功能，在角质细胞的氧化损伤中发挥重要作用[14]。

目前中药在改善皮肤水分及抗氧化应激、抗炎等方面的作用受到研究者越来越多的关注，中药类的护肤产品也逐渐受到大家的青睐。沐耄舒是专门针对老年人皮肤干燥、脱屑和瘙痒研发的药浴乳，亦适用于中老年人群的日常皮肤清洁护理。本研究对沐耄舒药浴乳中药成分浸提液对HaCaT 细胞的在屏障功能、抗氧化及炎性反应的影响进行了研究，发现该浸提液对HaCaT 细胞皮肤保湿以及屏障功能均有良好的促进作用，可以通过减少角质细胞内的ROS 含量、增加GSH 含量、影响氧化应激相关酶类的表达而促进HaCaT 细胞抗氧化功能，从而减少角质细胞的氧化损伤，也能够减弱角质细胞的炎性反应，改善人体皮肤。沐耄舒药浴乳配方中玄参、当归和地肤子清除氧化自由基能力较强，有很好的抗氧化及抗炎作用[15-17]；苦参被报道有抑制HaCaT 细胞增殖的作用，在皮肤科的治疗中应用广泛[18]；玉竹对HaCaT 细胞抑制氧化损伤，增强细胞抗氧化能力有重要的作用[19]；防风、天冬、土茯苓等在老年皮肤瘙痒、皮肤保湿及多种皮肤病的缓解和治疗中有较好的功效[20-22]；临床研究表明丹皮酚可以抗炎、镇痛、止痒，对老年人皮肤瘙痒症有良好的治疗效果[23]。

综上，本研究首次证明沐耄舒药浴乳中药成分浸提液能够从多方面减少角质细胞的损伤，促进人体皮肤健康。为沐耄舒药浴乳对中老年人群皮肤有润燥祛屑、疏风止痒、修护皮肤屏障的功效奠定了理论依据。