基于网络药理学探讨皮炎1 号方治疗荨麻疹的作用机制

郭晨琪，申倩，张浩月，马丛，张宇

（1.天津中医药大学，天津 301617；2.天津市中医药研究院附属医院，天津 300120）

荨麻疹是由于皮肤、黏膜小血管扩张及渗透性增加而出现的一种局限性水肿反应，临床上表现为大小不等的风团并伴有瘙痒，约有20%患者同时出现血管性水肿[1]。荨麻疹在中医学上称为“瘾疹”、“风骚痒”、“游风”等[2]。对于荨麻疹的治疗，西医采取对症施治，及时脱敏和使用抗组胺药物，中医则是根据辨证论治原则，口服中药汤剂调治，同时配合针灸等独特疗法，对于治疗荨麻疹有明显成效[3]。

皮炎1 号方为天津市中医药研究院附属医院院内制剂，加减化裁于名方荆防汤，适用于泛发性急性皮炎或风团皮肤病，包括丘疹状湿疹、婴儿湿疹、屈侧湿疹、下肢湿疹、泛发性神经性皮炎、瘙痒证、急性荨麻疹、丘疹状荨麻疹、玫瑰糠疹和多形性红斑等，在临床上取得了很好的疗效。

中药网络药理学是在系统水平上的中药药效学和中医药基础理论的联合，帮助医者们从分子、靶点、网络等多水平、多角度、可视化分析中药的活性成分及其对疾病产生的生物学效力[4]。本研究借助网络药理学，深入挖掘皮炎1 号方治疗荨麻疹的作用机制，为临床用药提供科学支持，为中药现代化提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 筛选皮炎1 号方的活性化合物和靶点 在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）数据库中分别检索荆芥、防风、连翘等11 味中药，得到每味中药的化学成分，其中生石膏、蝉衣未能找到相应化合物及靶点，故略去。根据口服利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（Druglikeness，DL）≥0.18 的属性值对检索到的所有化学成分进行筛选，收集到皮炎1 号方的活性化合物。通过TCMSP 数据库查找化合物的作用靶点，根据已发表的文献对药物靶点进行补充。在Uniprot 数据库中，将已知药物靶点蛋白转化为靶基因。

1.2 筛选疾病的高关联度靶点 在GeneCards、OMIM、PharmGkb 和TTD 数据库中检索关键词“Urticaria”，筛选出疾病高关联度靶点。在Excel 表中进行去重，得到最终的疾病靶点库。使用Uniprot 数据库将最终得到的基因靶点转化为靶基因。

1.3 疾病-化合物共同靶点的筛选 利用VennPainter软件，将皮炎1 号方活性化合物的作用靶点与疾病靶点取交集，筛选出二者共同的作用靶点。

1.4 药物-共同靶点-疾病网络的构建 将皮炎1号方中化合物、疾病以及二者的共同靶点蛋白上传至Cytoscape 软件（http：//www.cytoscape.org/）生成体现药物-共同靶点-疾病相互作用的网络图。

1.5 蛋白互作网络（PPI） 的构建 利用String（https：//string-db.org/）蛋白互作数据库和Cytoscape软件分析共同靶点蛋白之间的相互作用，选择高相关性，并用R 语言进行计数分析。

1.6 基因本体（GO）功能富集分析 利用Cytoscape软件对共同靶点蛋白进行GO 功能富集分析，以了解共同靶点蛋白在基因功能中的作用，通过Omicshare软件（http：//www.omicshare.com/tools/index，php/）对结果进行可视化处理。

1.7 京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 利用David（https：//david.ncifcrf.gov/）数据库和Cytoscape 软件将共同靶点进行KEGG 通路富集分析，对共同靶点蛋白在信号通路中的作用做注释分析，得到皮炎1 号方治疗荨麻疹的信号通路，通过Omicshare 软件对结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 皮炎1 号方化合物及作用靶点的筛选 利用TCMSP 分别查找皮炎1 号方中9 味中药的化合物及作用靶点，以“OB≥30%，DL≥0.18”为条件经过整理发现，皮炎1 号方中活性化合物共有124 种。查找皮炎1 号方中化合物的靶点，经Uniprot 数据库基因注释后，筛选得到134 个靶点。

2.2 疾病靶点及药物-疾病共同靶点的确定 利用Genecards、OMIM、PharmGkb 以及TTD 疾病数据库经Uniprot 数据库基因注释后，去除重复靶点，共筛选出999 个疾病靶点。与134 种化合物的靶点映射，利用VennPainter 软件，分析得出皮炎1 号方与荨麻疹的共同靶点有36 个，见图1。

图1 药物疾病共同靶点韦恩图

2.3 “药物-共同靶点-疾病网络”的构建与分析 利用Cytoscape 绘制的皮炎1 号方治疗荨麻疹的“药物-共同靶点-疾病网络”网络图，见图2。该图包括171 个节点，其中疾病节点1 个（黄色），方剂节点1个（橙色），中药节点9 个（绿色），靶点基因节点36个（红色），活性成分节点124 个（蓝色）。通过分析发现皮炎1 号方中最主要的前3 种活性成分为槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇。分析靶点节点度值较高的前3 个靶基因为前列腺素内过氧化物合酶、毒蕈碱型胆碱受体M、乙酰胆碱酯酶，提示这些基因可能是皮炎1 号方治疗荨麻疹的核心靶点。

图2 药物-共同靶点-疾病网络图

2.4 PPI 网络的构建与分析 利用String 蛋白互作数据库和C 语言分析共同靶点蛋白之间的相互关系，见图3。利用R 语言对PPI 中每个蛋白之间的相互关系进行计数，见图4。相互关系最多的蛋白前3位分别为白细胞介素-6（IL-6）、血管内皮生长因子-A（VEGF-A）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Caspase-3）。

图3 PPI 图

图4 PPI 核心蛋白柱状图（前30 个）

2.5 GO 功能富集分析 对皮炎1 号方与荨麻疹的共同靶点进行GO 功能富集分析，以错误发现率（FDR）＜0.05 为标准，确认了1 243 条结果，利用Omicshare 软件对结果进行可视化处理，展示前30个共同的基因功能，见图5，分别是对抗生素的反应、细胞对异物的反应、对金属离子的反应、G 蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路、对糖皮质激素的反应、对脂多糖的反应、对细菌源分子的反应、对皮质类固醇的反应、对缺氧的反应、对氧水平降低的反应、乙酰胆碱受体信号通路、对氧水平的反应、对乙酰胆碱的反应、细胞对乙酰胆碱的反应、对异型生物质的反应、对铁离子的反应、细胞对药物的反应、G 蛋白偶联血清素受体信号通路、外源性凋亡信号通路、突触后信号传导。

图5 GO 功能富集分析

2.6 KEGG 通路富集分析 对皮炎1 号方和荨麻疹的共同靶点利用DAVID 数据库进行KEGG 通路富集分析，以P＜0.01，FDR＜0.05 进行筛选，并将结果利用Omicshare 软件可视化。共涉及92 条信号通路，展示前30 个信号通路，见图6。主要包括前列腺肿瘤、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、晚期糖基化终产物-晚期糖基化终产物受体（AGE-RAGE）信号通路、肿瘤中的蛋白多糖，磷脂酰肌醇-3 激酶-蛋白激酶B（PI3K-AKT）信号通路、抗药性、p53 信号通路、人类疱疹病毒（EB）感染、人巨细胞病毒感染、肿瘤中的MicroRNA、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、突触胆碱能、胰腺癌、膀胱癌、表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂耐药、细胞凋亡、结肠癌、麻疹病毒、流体剪切损伤、军团菌病、子宫内膜癌、乙型肝炎、丙型肝炎、病毒性心肌炎、低氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路、甲型流感、弓形虫病、非小细胞肺癌、多物种凋亡和非洲锥虫病。

图6 KEGG 通路富集分析

3 讨论

荨麻疹是一种由肥大细胞驱动的常见疾病，表现为风团或血管性水肿或二者均有，其发病机制尚不完全明确，但普遍认为是IgE 介导的肥大细胞活化脱颗粒，释放以组胺为主的炎性介质是荨麻疹发病的关键环节[5]。最近的研究集中在嗜碱性粒细胞在荨麻疹中的作用上，在荨麻疹患者的血清中检测到IL-31 水平升高，而IL-31 由嗜碱性细胞释放，可能刺激嗜碱性细胞趋化并激活IL-4 和IL-13 的释放[6]。有研究表明荨麻疹患者嗜碱性细胞上CD63 的表达增加与过敏致敏、血清自身反应和嗜碱性细胞反应相关[7]。

皮炎1 号方的现代药理学研究表明，本方荆芥、防风都有解热、抗炎、镇痛、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、影响机体免疫功能等作用[8-9]。黄芩中的化合物黄芩素，能显著抑制炎性因子IL-6和TNF-α 的释放以及炎性介质前列素（PG）E2 和一氧化氮（NO）的产生，且呈良好剂量依赖关系[10]。黄芩苷有明显的抗氧化的效果，有研究结果显示黄芩苷可以通过促进内皮依赖性血管舒张和抑制人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的细胞凋亡改善内皮功能受损，其中黄芩苷能降低Caspase-3 的表达，并增加B 细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）的表达[11]。苦参中的苦参碱，可通过抑制磷脂酶A2 和环氧化酶抑制炎性介质前列腺素生物合成以及抑制花生四烯酸转化成白三烯，也可通过稳定细胞膜抑制肥大细胞释放组胺和直接竞争组胺H1 受体，产生抗炎作用[12]。白鲜皮提取物有止痒的效果[13]。丛欢等[14]在研究白鲜皮提取物对致痒阈值的影响过程中发现，白鲜皮提取物能显著提高豚鼠局部致痒阈值，白鲜皮提取物高、中剂量组对组胺致豚鼠局部瘙痒有一定的抑制作用。

由“中药-化合物-靶点”网络可知槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇是皮炎1 号方主要的前3 种活性成分，协同作用于多个靶点发挥对荨麻疹的治疗作用。槲皮素有抗病毒、抗氧化、抗辐射作用，可通过抑制组胺释放、降低嗜酸性粒细胞百分比和减少肥大细胞脱颗粒，而缓解血管扩张[15]，还可通过抑制环氧化酶-2（COX-2）和抗IgE 抑制Ⅰ型变态反应[16]。山奈酚可显著降低脂多糖诱导的胎膜促炎细胞因子（IL-6 和IL-8）和PGE2 和PGE2α 的分泌，可用来预防炎性反应并减少其损害[17]。β-谷甾醇能抑制炎性细胞的浸润以抑制血清中IgE、IL-4 和组胺的产生，并在不同类型的急性炎性反应中有显著的抗炎能力，通过控制炎性细胞因子的产生来调节免疫功能[18]。

根据PPI 图可知皮炎1 号方和荨麻疹共同靶点相互关系最多的前3 位蛋白分别为IL-6、VEGFA、Caspase-3。IL-6 被证明是一种原型细胞因子，对炎性、免疫反应和造血功能有多效作用，并通过刺激抗体产生并诱导幼稚CD4＋的分化，在获得性免疫应答中也起重要作用[19]。IL-6 可以以信号转导与转录激活因子（STAT3）依赖性方式增强免疫球蛋白受体（FcεRI）诱导的COX-2 表达、前列腺素D-2（PGD-2）生物合成和VEGF 的产生，并通过促进组织内肥大细胞产生炎性PGD-2 而参与人类过敏性疾病[20]。PI3K 参与内皮细胞微管的形成，也参与内皮细胞增殖、存活、迁移和血管通透性的形成[21]。

通过GO 富集分析发现，皮炎1 号方治疗荨麻疹筛选出的核心蛋白主要发生在BP 环节，如对氧气水平的反应、对类固醇激素的反应、对糖皮质激素的反应和皮质类固醇反应等。KEGG 通路富集涉及多条抗荨麻疹关键通路，包括PI3K-AKT 信号通路、TNF 信号通路、p53 信号通路和HIF-1 信号通路等。研究发现荨麻疹患者PI3K-AKT 和HIF-α 通路以IgE 依赖的方式诱导肥大细胞中VEGF 的产生，并使核因子-κB（NF-κB）的磷酸化和HIF-α 的表达水平增加，AKT 充当P13K 的下游调节剂，通过控制HIF-α 来调节VEGF 基因表达[22]。TNF 通路的失调是包括败血症，癌症以及自身免疫和炎性疾病在内的多种疾病的关键特征和致病因素[23]。荨麻疹与TNF 信号通路的激活有关，其标志为sTNF-R1和sTNF-R2 的循环浓度升高，可能是该疾病全身炎性反应的一部分[24]。

综上所述，皮炎1 号方中含有多种药效成分可以从多个层面发挥对荨麻疹的治疗作用，每个有效成分均作用于多个靶点，且文献调研发现大多核心靶点确实与荨麻疹治疗相关。此外，GO 和KEGG 富集分析有助于帮助医者们进一步理解皮炎1 号方相关靶点蛋白参与表达的生物学通路，为后续进一步提高皮炎1 号方的安全性、有效性提供了科学依据，推动了中医药现代化的研究发展。