人参皂苷CK 对H2O2 诱导人黑素细胞凋亡的保护作用

唐苏为，陆家睛，谢韶琼，姜文成，赖竞思，杨伶俐，片山一朗，张慧敏

（1.同济大学附属皮肤病医院，上海 200443，2.大阪市立大学色素病症治疗共同开发部门，日本 大阪 5450051，3.上海中医药大学附属曙光医院，上海 201204）

白癜风是一种获得性慢性色素脱失性疾病，表现为局部表皮功能性黑素细胞选择性丧失，全球患病率为0.5%～2%，本病易对患者造成极大的心理负担，需要及时有效的治疗[1]。白癜风的发病机制尚不完全清楚，可能与遗传、免疫、神经、生化和环境内外因素有关。近年来越来越多的研究表明，氧化应激会引起黑素细胞的损伤和凋亡，是白癜风发病和进展的关键因素[2]。因此，使用抗氧化剂来减少或逆转表皮中的氧化应激损伤从而恢复黑素细胞功能的治疗策略已引起越来越多学者的研究兴趣。人参皂苷化合物K（Compound K，CK）属二醇型人参皂苷，其结构为20（S）原人参二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，见图1，是人参皂苷在人肠道内的主要代谢产物，并经吸收入血成为人参皂苷在体内的主要成分，也是人参发挥生物活性的主要成分，可从人参、三七等富含人参皂苷的中药材中转化获得其单体化合物[3]。CK 的药理作用主要包括抗炎、抗动脉粥样硬化、抗癌和神经保护[4-7]等。在皮肤科领域，有研究证实CK 可用于对抗皮肤衰老、改善皮肤的整体状况[8-9]。然而，对于CK 在黑素细胞中的作用，医者们知之甚少。本研究通过使用H2O2诱导的来自新生儿中度色素沉着性包皮的正常人表皮黑素细胞（HEMn-MP）氧化应激作为体外模型，探索CK 对经氧化应激损伤后的人黑素细胞的保护作用并阐明其潜在的分子机制，为探讨CK 对白癜风的治疗作用提供理论依据。

图1 CK 化学结构式

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞 HEMn-MP 细胞购自美国Thermo Fisher Scientific 公司。

1.1.2 试剂 人参皂苷CK（纯度：＞98.0%，四川维科奇生物科技有限公司），M254 细胞培养基、人类黑色素细胞生长补充剂、溴化乙锭（EB）、Hoechst 33342（美国Thermo Fisher Scientific 公司），过氧化氢H2O2（日本WAKO 公司），二甲基亚砜（DMSO）、半胱天冬酶-3（Caspase-3）比色试剂盒（美国Sigma公司），磷酸激酶抗体阵列检测试剂盒（R&D system公司），胰蛋白酶（日本Nacalai Tesque 公司）、PBS缓冲液（日本Fujifilm Wako 公司）。

1.1.3 仪器 ImageQuant TL 图像分析软件（GE Healthcare 公司），自动酶标仪（550 型，美国Bio-Rad Laboratories 公司），共聚焦荧光显微镜（Keyence公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 复苏HEMn-MP 细胞，加入含1%人黑素细胞生长补充剂的M254 培养基，于37 ℃、5%CO2孵箱内培养。0.25%胰蛋白酶消化传代，取第8～11 代细胞用于做本次实验。实验前将细胞以5×105个细胞/孔的密度接种到6 孔板中继续培养12 h后加药刺激。

1.2.2 分组 共分3 组，空白对照组、0.4 mmol/L H2O2组、0.4 mmol/L H2O2+0.625 μg/mL CK 组。

1.2.3 磷酸激酶抗体阵列检测 使用磷酸激酶抗体阵列检测（ARY003B，R&D Systems）分析磷酸化激酶，根据试剂盒说明检测HEMn-MP 细胞各阵列蛋白磷酸化水平，每个阵列加入300 μg 蛋白质裂解物，使用图像分析软件（ImageQuant TL，GE Healthcare）量化斑点的像素灰度值。

1.2.4 Caspase 3 活性检测 使用比色试剂盒（CASP3C-1KT）测定Caspase-3 活性，根据试剂盒说明检测Caspase-3 活性。该试剂盒基于Caspase-3对Ac-DEVD-pNA 的水解，从而产生对硝基苯胺（pNA）部分。在405 nm（εmM=10.5）处检测到pNA。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0 软件对实验数据进行t 检验或多因素方差分析用来比较各组之间的差异。实验数据以均数±标准差（±s）表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CK 减弱H2O2诱导的HEMn-MP 细胞p53 蛋白磷酸化 磷酸激酶抗体阵列检测结果显示，在黑素细胞中使用H2O2刺激3 h 后，Ser15 和Ser46 处的p53 磷酸化显着增加，并且其他p53 相关磷酸化位点没有变化，而CK 预处理后减弱了H2O2诱导的Ser15 和Ser46 处p53 磷酸化，见图2。

图2 CK 对培养的人表皮黑素细胞p53 蛋白磷酸化的影响

2.2 CK 降低H2O2诱导的Caspase-3 活化 使用比色法测定HEMn-MP 细胞中的Caspase-3 活化，观察到Caspase-3 在经H2O2刺激后被激活、活性显著增加，而在CK 预处理后Caspase-3 的活性则显著降低，见图3。

图3 CK 对H2O2 诱导的Caspase-3 活化的影响

3 讨论

氧化应激是细胞过度产生或不充分清除活性氧分子的结果，其特点是自由基形成与身体抗氧化能力之间的不平衡，可能导致蛋白质、脂质及核酸等不同分子的非特异性损伤[10]。皮肤是人体身体最大的屏障器官，每天受紫外线辐射、空气污染、病原体、化学物质等侵袭，很容易引起皮肤中各类细胞的损伤[11]。皮肤在受到外源性刺激时可产生大量的氧自由基，当自由基的产生超出机体清除能力时，就会产生氧化应激，同时，细胞有氧代谢也会产生少量H2O2、HO-等活性氧自由基，越来越多的学者认为白癜风的发生与氧化应激损伤密切相关，已有研究证实，在进展期白癜风患者表皮中可检测到过量蓄积的H2O2[12]。由于黑色素合成过程中产生的促氧化状态[13]，此外，氧化应激可诱导CD8+T细胞趋化攻击黑素细胞[14]，故皮肤中的黑素细胞特别容易受到氧化应激的影响，寻找适合的抗氧化剂，通过针对性的抗氧化治疗阻断自身免疫攻击、保护黑素细胞为白癜风的治疗提供了新的思路。中药等是天然抗氧化剂的主要来源，实验证明多种中药提取物可发挥抗氧化作用，安全性较高，在白癜风的治疗中有较好的应用前景，此外，药物化学提取技术的日趋进步也为研究天然抗氧化化合物以改善氧化应激相关的皮肤病铺平了道路。

CK 作为人参和三七的主要成分人参皂苷的肠道代谢产物，被证实在多种氧化应激相关条件下均能起到保护作用：CK 通过增加超氧化物歧化酶水平和谷胱甘肽过氧化物酶活性来改善肝脏抗氧化活性[15]；CK 通过显着减少氧化应激来预防肾病[16]；CK 通过对神经系统激活抗氧化应激增强记忆力[17]。然而，CK 是否可以保护黑素细胞免受氧化应激尚未见他人报道。基于此，笔者进行了前期研究，并且发现CK 可以保护人类黑色素细胞免受H2O2诱导的细胞损伤[18]，为了探究其可能的分子机制，在查阅相关文献后，笔者采用HEMn-MP 细胞作为为研究对象，以H2O2作为诱发氧化应激损伤的因素，建立体外模拟氧化应激的黑素细胞模型，研究了CK 对H2O2诱导氧化应激引起的黑素细胞凋亡的影响。

黑素细胞的过度氧化应激会触发内在凋亡途径并最终介导细胞死亡[19]，p53 蛋白则被称为细胞凋亡的关键调节因子，p53 以“分子警察”的身份监控细胞的生长过程，一旦细胞受损，p53 蛋白表达水平会很快升高，并抑制DNA 复制、刺激DNA 切除修复，p53 含有一系列丝氨酸（S）/苏氨酸（T）磷酸化位点，p53 的磷酸化在调节其激活以诱导细胞凋亡方面起着关键作用[20]。根据本次研究磷酸激酶阵列检测结果显示，在黑素细胞中用H2O2刺激3 h后，Ser15 和Ser46 点位处的p53 磷酸化显着增加，而其他p53 相关磷酸化位点则没有变化，CK 预处理后则减弱了H2O2诱导的黑素细胞Ser15 和Ser46处的p53 磷酸化。与此同时，笔者结合溴化乙锭（EB）和Hoechst 33342 染色来分析CK 对H2O2诱导的细胞死亡的影响，结果显示用H2O2处理后死亡细胞的比例增加，而在CK 预处理后则死细胞比例有所减少。由于Caspase-3 是内切蛋白酶家族的成员，被称为细胞凋亡中的刽子手，并在细胞凋亡中发挥核心作用[21]，因此，笔者测定了黑素细胞中的Caspase-3 活化的程度，观察到Caspase-3 活性在H2O2诱导下被极大地触发，而CK 预处理后则能使其活性降低。

综上所述，CK 在减弱H2O2诱导的HEMn-MPs细胞凋亡方面有一定的潜力，CK 可以作为一种抗氧化剂为预防和治疗白癜风提供新的思路。