基于网络药理学探讨蛇莓-白英治疗银屑病的作用机制

陈佳祺，张泽涵，孔维嘉，金琦，陈健鹏，王雪茜

（北京中医药大学，北京 100029）

中医药在我国广泛应用于银屑病治疗，可起到改善皮损及其他主客观症状、减缓复发等作用。中药蛇莓、白英是有调节免疫、抑制肿瘤生长的“免疫调节中药”，常单独或配伍治疗银屑病血热证[1-2]。蛇莓始见于《名医别录》，现代常用于治疗热毒炽盛诸症及肿瘤的治疗，许逊哲等[3]基于集对分析疗效曲线与偏联系数分析认为蛇莓是治疗银屑病血热证的优选药物。白英为本经中的上品药，有清热解毒，利湿消肿的功效常用于丹毒等热性皮肤病证属热毒内蕴者[4]。王玉玺教授从“毒”论治银屑病，认为白英是治疗“湿毒”之佳品[5]。白彦萍教授临床喜用“蛇莓-白英”药对，认为其有较好的清热解毒凉血之力，切中银屑病“血分郁热”的核心病机，为其经验方祛银颗粒、清热凉血方[1-2]中重要组成。尽管二药搭配运用于银屑病的治疗中取得了不错的疗效，但其作用机制尚待明确。

近年来，网络药理学凭借其“多成分-多靶点-多途径”的网络构建思想与中医理论的“整体”观念相符合，被广泛用于中药药对、复方作用机制研究，特别在作用靶点预测方面起到重要作用。因此，笔者通过网络药理学的方法，筛选蛇莓-白英的活性成分，通过基因本体（GO）功能富集分析和基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析等方法寻找其在治疗银屑病过程中的重要靶点，以探讨其对治疗银屑病的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 筛选活性成分及相应靶点 以蛇莓（SHE MEI）为关键词，从中药分子作用机制网络药理学在线分析平台（Batman-TCM）数据库（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）中获得其所有化学成分。把Score cutoff≥10 和P≥0.05 作为筛选条件，从而得到其活性成分及活性成分的作用靶点基因。以白英为关键词，在中国知网上进行文献检索，分析所得文献找出其主要化学成分。从中药系统药理数据库及分析平台（TCMSP）数据库中获得其相关靶点。在TCMSP数据库中搜索不到的化学成分则先用Pubchem 数据库获得其化学式，然后在Swiss Target Prediction数据库中获得其相关靶点。然后将靶点名称输入UniProt 数据库（https：//www.uniprot.org/）获得其相应靶点的人源的靶点基因名称。

1.2 筛选疾病相关靶点 以银屑病（Psoriasis）为关键词，在GeneCards 在线和OMIM 数据库中检索，从而获得银屑病相关的靶标。

1.3 筛选药物与疾病的共同靶点并绘制药物-疾病相关网络 运用R 软件，将1.1 中得出的药物靶点基因与1.2 中得出的疾病相关靶点基因进行筛选，得出药物与疾病的共同靶点基因。 通过Cytoscape3.7.1 软件，构建蛇莓、白英药对的化学成分、化学成分的相关靶点蛋白基因、疾病相关靶点基因的药物-化合物-靶点-疾病网络。

1.4 蛋白互作网络的构建及网络核心基因的筛选 将1.3 中得到的药物与疾病的共同靶点基因上传至STRING 在线分析平台（https：//string-db.org/）上，获取蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）。并运用R 软件得出PPI 网络中的核心基因。

1.5 通路富集分析 先采用bioconductor 程序包中的clusterProfiler 包以及R 软件找出药物与疾病共同靶点蛋白的基因ID，然后运用以上2 个软件进行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析，并将其结果可视化。

2 结果

2.1 蛇莓-白英药对的主要活性成分的筛选结果通过Batman-TCM 数据库以及中国知网CNKI 检索的方式筛选出活性化合物17 个，其中6 个来自于蛇莓，11 个来自于白英，蛇莓、白英中含有的17 个化合物的基本信息，见表1。

表1 蛇莓、白英的活性化合物

2.2 活性成分靶点、疾病靶点及药物疾病共同靶点 从Batman-TCM 数据库得到蛇莓的靶点基因共37 个，其中1 个化合物无相关的靶点基因。通过TCMSP 以及Swiss Target Prediction 数据库获得白英的靶点基因共164 个，其中2 个化合物搜索不到与其相关的靶点基因。2 种药物均有的靶点有9 个。通过GeneCards 和OMIM 数据库获得银屑病相关靶点3 740 个。通过R 软件筛选获得蛇莓-白英药对与银屑病共同靶点有101 个，并绘制韦恩图，见图1。

图1 药物靶点和疾病靶点的韦恩图

2.3 药物-疾病相关网络的构建与分析 运用Cytoscape3.7.1 软件绘制出药物-化合物-靶点-疾病网络。网络图中共包括118 个节点（1 个疾病、2 个药物、14 个化合物、101 个靶点）和242 条边。菱形节点代表研究的疾病，六边形节点代表研究药物，三角形节点代表活性化合物，椭圆形节点代表潜在靶点。见图2。

图2 药物-成分-靶点-疾病网络

2.4 PPI 的构建及分析 应用STRING 在线分析平台对药物与疾病的共同靶点基因构建PPI网络。网络中包含95 个节点数，平均度值为18.0，见图3。并应用R 软件筛选出其中度值最高的30 个基因作为该网络中的核心基因。见图4。

图3 PPI 图

图4 PPI 图核心基因

2.5 GO 功能富集分析 运用bioconductor 程序包中的clusterProfiler 包以及R 软件对药物与疾病的交集基因进行GO 功能富集分析。筛选到P＜0.05 的GO 条目98 个，涉及脂肪酸、羧酸等有机酸结合、核受体活性、细胞因子活性、细胞因子受体结合、类固醇激素及激素受体结合等生物过程。按照P 由小到大排列的前20 条主要生物过程，见图5。

图5 GO 功能富集分析

2.6 KEGG 通路富集分析 运用bioconductor 程序包中的clusterProfiler 包以及R 软件对药物与疾病的交集基因进行KEGG 通路富集分析。筛选到P＜0.05的KEGG 信号通路145 条。主要涉及表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂抵抗通路（EGFR-TKIs）、血管内皮生长因子（VEGF）信号通路、白细胞介素-17（IL-17）信号通路及利什曼病、结直肠癌、卡波西肉瘤、乙型肝炎、丙型肝炎、百日咳等疾病相关通路。按照P 由小到大排列的前20 条主要信号通路，见图6。

图6 KEGG 通路富集分析

3 讨论

银屑病是一种临床常见的慢性自身免疫性皮肤疾病，其发病机制尚未完全明确。既往研究表明其发病与多基因、多种免疫细胞及细胞因子相关，可因各种病原微生物感染而发病或加重。近年来，中医药对银屑病作用机制的研究不断深入，主要涉及包括辅助性T 细胞1（Th1）、Th2、Th17、Th22 和调节性T 细胞（Treg）细胞在内的T 辅助细胞及其细胞因子的调控、角质形成细胞的过度增殖[6]。但对于具体方药作用靶点与通路的预测有待进一步研究。

凉血活血和清热解毒是中医药治疗进展期银屑病的常规治法[7]。蛇莓、白英功善清热解毒和凉血消肿，是肿瘤科常用对药。药理研究表明，除了干扰细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡、调节免疫等抗肿瘤作用外，还有降低血管通透性、抑菌、抗血管新生、抗病毒等作用，在治疗带状疱疹、炎性反应等皮肤疾病方面有前景[8-10]。近来年，白彦萍等[1]、李锘等[2]常将这一药对应用于银屑病的中医治疗，以期起到抗炎消肿、抑制鳞屑产生、减小红斑面积的效果。

本研究发现，蛇莓-白英药对共有17 个有效成分（蛇莓6 个、白英11 个），对应靶点164 个，其中与银屑病相关靶点101 个，GO 与KEGG 富集分析分别得到98 及145 条潜在相关信号通路，可推测蛇莓-白英对于银屑病的治疗效果与多靶点、多通路相关。通过蛋白互作网络的构建、分析、筛选得到IL-6、VEGFA、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、表皮生长因子受体（EGFR）、过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARG）等30 个核心基因。上述研究表明蛇莓和白英治疗银屑病的作用与炎性反应、表皮过度增殖、新生血管增生这3 个生物过程相关，这与银屑病的发病机制相符[1]。

GO 功能富集分析显示“蛇莓-白英”药对治疗银屑病的机制与脂肪酸、羧酸等有机酸结合、核受体活性、细胞因子活性、细胞因子受体结合等生物过程有着密切的关系。既往研究表明IL-17、IL-23、IL-9、TNF-α 等细胞因子在银屑病发病过程中有重要作用，可通过炎性反应、免疫调节等生理过程影响银屑病的发生发展[11]。蛇莓和白英2 种药物有一定的增强免疫功能及抗炎活性作用，本研究表明其增强免疫与抗炎功能可能与影响细胞因子活性及细胞因子受体结合过程相关。另外，Baran 等[12-13]研究发现脂肪酸结合蛋白（FABP1）和FABP4 可以作为新的银屑病标志物，可为银屑病的治疗提供新的靶点。由蕾等[14]认为维甲酸可以通过作用于相关的特异性核受体而干扰角质细胞的形成与分化，从而可以用于银屑病的治疗。银屑病皮损皮肤中维甲酸受体显示出异常的分布顺序，可以导致银屑病表皮中混乱的维甲酸信号和分化失调，可以用于解释银屑病皮损中出现的角化过度和角化不全。可以看出，脂肪酸等有机酸结合过程及核受体活性与银屑病发生密切相关。本研究表明“蛇莓-白英”药对治疗银屑病的机制很可能与上述生物过程有关。

KEGG 通路富集分析显示“蛇莓-白英”药对治疗银屑病的潜在通路有145 条。经过相关文献查笔者认为其机制主要与VEGF 通路、IL-17 信号通路、EGFR-TKIs 等有关。

VEGF 通路信号通路与银屑病皮肤炎性反应有密切的关系。VEGF-A 是血管新生过程中VEGF 信号通路促进基底膜分解的主要因子[15]，在银屑病患者皮损中呈现高表达[16]。Helia 等[17]研究表明抗VEGF 能够显著降低银屑病小鼠皮肤炎性反应。韩林[18]研究表明，白英生物碱SA2 能够通过破坏细胞膜小窝结构，抑制VEGF/VEGFR2 上下游血管新生相关通路的正常运转；许扬等[19]研究表明蛇莓水煎剂能够减小鸡胚绒毛尿囊膜血管新生面积，破坏组织大中血管结构。因此，笔者猜测蛇莓-白英药对可能通过调控VEGF 水平抑制新生血管增生从而治疗银屑病。见图7。

图7 VEGF 信号通路

IL-17 是Th17 细胞的标志性细胞因子，其亚型IL-17A 与IL-17F 与银屑病相关。研究表明，进行期银屑病患者血清IL-17 水平明显高于对照组[20]，其作用机制可能与激活有丝分裂原活化蛋白（MAP）激酶、核因子-κB（NF-κB）等信号通路，在干扰素-γ（IFN-γ）的协同下刺激角质形成细胞分泌IL-6、GM-CSF 等炎性因子相关[21]。其抑制剂secukinumab、ixekizumab、brodalumab 已获批用于中、重度银屑病的治疗[22]。IL-17 信号通路显示IL-17 可以通过激活NF-κB，促进IL-6、TNF-α 等细胞因子的释放从而起到调节免疫及诱发炎性反应的作用。见图8。

图8 IL-17 信号通路

在正常的表皮组织中，EGFR 主要存在于基底细胞层，而在银屑病患者皮肤基底层和棘层也呈现广泛表达，其作用机制可能与通过酪氨酸激酶（TK）通路与表皮生长因子（EGF）及其家族成员相结合，促进角质形成细胞（KC）的过度增殖分化相关。EGFR-TKIs 是以EGFR 作为靶点，通过与三磷酸腺苷（ATP）竞争性结合胞内的TK 结构域配体结合位点，抑制EGFR 分子内酪氨酸的自身磷酸化和TK活化，阻断下游信号转导过程，从而发挥诱导细胞周期停滞、促进细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成、浸润和转移等作用[23]。PI3K/Akt 通路在EGFR-TKIs 抵抗过程中发挥重要作用，有研究发现，银屑病患者PI3K 基因表达水平、皮损内P-Akt 蛋白水平及Akt激酶活性明显高于正常皮肤，可引起胶质细胞的过度增殖和真皮乳头血管增生[24]。郭晶等[25]研究证实很多清热解毒类中药均可能有TK 抑制活性。蛇莓、白英有明显的清热解毒功效，本研究初步表明其治疗银屑病的机制可能与抑制TK 活化有关。但目前尚未有研究明确表明蛇莓、白英可抑制TK 活性，本研究可为未来相关研究提供理论参考。见图9。

图9 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂抵抗信号通路

此外，KEGG 通路富集分析还发现利什曼病、结直肠癌、卡波西肉瘤、乙型肝炎、丙型肝炎、百日咳等疾病可能与银屑病的发生有关，这与既往研究表明银屑病将增加其患病风险相符，可供进一步深入研究[26]。

综上所述，蛇莓-白英对银屑病治疗有多靶点、多途径、多通路的特点。其生物学机制可能与有机酸结合、核受体活性、细胞因子活性、细胞因子受体结合等生物过程及VEGF 信号通路、IL-17 信号通路、EGFR-TKIs 相关通路等相关，为后续深入验证“蛇莓-白英”治疗银屑病的作用机制奠定基础。