基于拉曼光谱法所建的多元校正模型预测烟草中绿原酸和芸香苷的含量

黄天雄 ,于 洁 ,贾 楠 ,张若秋 ,沈晓洁 ,沙云菲 ,杜一平*,李 龙

(1.华东理工大学 化学与分子工程学院 上海功能性材料化学重点实验室,上海 200237;2.上海烟草集团有限责任公司 烟草行业卷烟烟气重点实验室,上海 201315;3.河南省科学院 化学研究所有限公司,郑州 450002)

多酚类化合物属于一类具有芳香环,且芳香环上带有一个及一个以上羟基官能团的化合物。多酚类化合物属于植物体内的次生代谢产物,广泛分布于植物的叶、果、皮等部位,且含量较高,可参与植物体内多种关键代谢过程[1]。烟草中也含有丰富的多酚类化合物,含量和组成与烟草种类、生长环境以及处理方式有关。烟草中的多酚类化合物主要以葡萄糖苷和酯等形式存在,有单宁类(绿原酸、新绿原酸等)、黄酮类(芸香苷、葡萄糖苷等)和香豆素类(莨菪亭、七叶亭等)化合物等,其中绿原酸和芸香苷含量较高。多酚类化合物不仅对烟草的生长发育过程有重要作用,还对烟草香气、色泽、安全性等影响较大,如绿原酸在热解下会产生2B 类致癌物儿茶酚[2],故多酚类化合物含量是评价烟草品质的一项重要指标[3],快速准确测定烟草中多酚类化合物含量很有必要。

烟草中多酚类化合物的测定方法主要有胶束色谱法[4]、高效液相色谱法(HPLC)[5]、超高效液相色谱-串联质谱法[6]。这些基于色谱技术的方法都需要较长的分析时间,不适用于大量样品的快速测定,也无法满足现场检测的需求。拉曼光谱法不仅分析快速,还能提供化合物分子结构特征,满足快速定性、定量的分析要求。将拉曼光谱法和化学计量学结合,还能拓宽拉曼光谱的应用范围,应用于化学检测[7]、食品分析[8]和疾病诊断[9]等领域,如:文献[10]用拉曼光谱结合化学计量法建立模型,实现卷烟中多酚类化合物含量的快速预测;文献[11]利用拉曼光谱法和衰减全反射红外光谱法(ATR-IR),研究了中国黄酒中多酚类化合物总含量及其抗氧化性能,发现与基于ATR-IR 所建模型相比,基于拉曼光谱法所建模型的效果更好;文献[12]分别基于拉曼光谱、红外光谱和近红外光谱用偏最小二乘法(PLS)建模,发现基于拉曼光谱法所建模型效果更好。由于烟草中绿原酸和芸香苷的主要拉曼特征峰重叠,无法直接进行定量分析,鉴于此,本工作以多元校正方法构建基于PLS的绿原酸和芸香苷的定量分析模型,并应用于实际样品中这两种多酚类化合物的预测,可为烟草品质的评价提供技术支持。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Lab RAM HR Evolution型紫外、可见、红外显微共焦拉曼光谱仪,配开放式显微镜、3 个激光器(325 nm He-Cd 激光器,激光最大输出功率25 m W;532 nm Nd:Yag激光器,激光最大输出功率100 m W;785 nm 固体激光器,激光最大输出功率100 m W)、15倍紫外物镜(数值孔径0.32,工作距离85 mm)。

芸香苷一级标准溶液:1 000 mg·L-1。

绿原酸一级标准溶液:1 000 mg·L-1,分别取100 mg绿原酸标准品,用30 mL 甲醇溶解后,用50%(体积分数,下同)甲醇溶液定容至100 mL 棕色容量瓶中,于4 ℃冰箱保存,保存期为3个月。

绿原酸、芸香苷二级标准溶液:100 mg·L-1,取10 mL一级标准溶液于100 mL 棕色容量瓶中,用50%甲醇溶液稀释至刻度,摇匀备用。

混合标准溶液系列:分别取一级标准溶液1,2,5 mL,二级标准溶液1,2,5 mL 于6个100 mL 棕色容量瓶中,用50%甲醇溶液稀释至刻度,配制成1,2,5,10,20,50 mg·L-1的混合标准溶液系列。

甲醇、丙酮、乙酸均为色谱纯;绿原酸标准品的纯度不小于97.0%;试验用水为超纯水(电阻率18.2 MΩ·cm)。

试验样品均为烤后烟叶,以Kennard-Stone法(KS法)划分为120 个样品,其中校正集和预测集样品分别有90,30个,2种样品中绿原酸和芸香苷含量均覆盖日常检测范围。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 拉曼光谱条件

光谱采集范围为800～2 000 cm-1;积分时间10 s;激发波长325 nm,输出功率12.5 m W。

1.2.2 HPLC条 件

BEH-C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm);柱温25 ℃;进样量2μL;检测波长340 nm;分析时间6.5 min;流量0.25 mL·min-1;流动相A 为含2%(体积分数,下同)甲酸的10%(体积分数)甲醇溶液,B为含2%甲酸的88%(体积分数)甲醇溶液。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Program of gradient elution

1.3 试验方法

1.3.1 拉曼光谱法

取(0.100 0±0.001 0)g烟叶的烟末,加入50%甲醇溶液10 mL,摇匀后超声振荡30 min,静置30 min,取上层澄清溶液过0.22μm 滤膜,取2 mL滤液保存于棕色玻璃色谱瓶中。分取200μL 于拉曼光谱仪的液体池中,调节显微镜使激光光斑聚焦在液体表面,按照1.2.1节拉曼光谱条件测量,每个样品重复测量5次,用平均光谱数据建模。

1.3.2 HPLC

取(0.050 1±0.000 1)g烟叶的烟末,加入50%甲醇溶液10 mL,摇匀后超声振荡20 min,静置至室温。过0.22μm 滤膜,滤液置于2 mL 棕色样品瓶中,按照1.2.2节HPLC条件测定,所得结果作为参考值。

1.4 建模方法

光谱平滑方法采用Savitzky-Golay卷积平滑法(即SG 平滑法),窗口大小设置为15,多项式最高次数设置为2。以Monte-Carlo交互检验法选择PLS模型隐变量数目,其中绿原酸和芸香苷隐变量数目均设置为7,随机次数设置为500次。绿原酸和芸香苷的建模区间为1 555.8～1 652.9 cm-1,最后再利用PLS 建立模型,并以校正均方根误差(RMSEC)、预测均方根误差(RMSEP)、校正集决定系数()、预测集决定系数()等指标来评价模型效果。

2 结果与讨论

2.1 HPLC分析结果

按照1.2.2节HPLC条件分析混合标准溶液系列,以目标物的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。所得标准曲线的线性范围均为5～50 mg·L-1,绿原酸线性回归方程为y＝1.470×104x-1.660×104,相关系数为0.999 6;芸香苷的线性回归方程为y＝1.110×104x-3.220×102,相关系数为0.999 9。以所建标准曲线分析120个烟草样品,并以公式(1)计算目标物的质量分数。

式中:wi为样品中目标物i的质量分数,mg·g-1;10为萃取剂体积,m L;n为样品溶液的稀释倍数,一般取n＝1;ρi为目标物i的参考值,g·L-1;m为称样量,g;w水为样品中含水量(按照YC/T 31-1996《烟草及烟草制品 试样的制备和水分测定 烘箱法测定》),%。

由HPLC 测得120个样品中绿原酸和芸香苷的质量分数为5.84%～28.75% 和5.01%～20.25%,平均值为12.06%,9.94%。

2.2 烟草中的绿原酸和芸香苷拉曼光谱分析

绿原酸、芸香苷、50%甲醇溶液和实际烟草样品溶液的拉曼光谱图见图1。

图1 绿原酸、芸香苷、50%甲醇溶液和烟草样品溶液的拉曼光谱图Fig.1 Raman spectra of chlorogenic acid,rutin,50%methanol solution and tobacco sample solution

由图1可知:绿原酸在1 605 cm-1和1 630 cm-1有明显特征峰,分别归属于苯环的伸缩振动和C＝C 双键伸缩振动[13-14];而芸香苷在1 303,1 363,1 419,1 497,1 567,1 609 cm-1处有明显特征峰,归属于母核与芸香糖引起的＝CH、-CH伸缩振动叠加峰、母核C＝C 伸缩振动、芸香糖-CH面内扭转、芸香糖C-C 伸缩振动,以及各种取代苯的特征谱带[15];甲醇在1 018 cm-1处有1个特征峰,归属于C-O 伸缩振动[14]。基于以上结论,实际样品在1 018 cm-1处的光谱峰对应的物质为甲醇,而1 605,1 630 cm-1处的特征峰对应的物质可能为绿原酸或芸香苷。

2.3 激发波长的选择

选用3种激光器检测实际样品,考察了不同激发波长(325,532,785 nm)对实际样品中绿原酸和芸香苷检测结果的影响,结果见图2。

图2 烟草样品溶液在激发波长分别为325,532,785 nm 时的拉曼光谱Fig.2 Raman spectra of tobacco sample solution at excitation wavelengths of 325,532,785 nm

由图2可知,在325 nm激发波长下的拉曼光谱中观察到明显的绿原酸的特征峰,而532,785 nm激发波长下则没有,这是由于532 nm 下的拉曼光谱受荧光背景干扰严重,且扣除背景仍无法消除,而根据散射定律[16],拉曼光谱信号强度与入射波长的四次方成反比,325 nm 下采集的信号更强。因此,试验选择拉曼光谱的激发波长为325 nm。

2.4 萃取溶剂的选择

根据参考文献[17],试验考察了萃取溶剂分别为体积分数均为50%的甲醇溶液、乙醇溶液和丙酮溶液时对实际样品中绿原酸和芸香苷检测的影响,结果见图3。其中,曲线(a)、(c)、(e)分别为纯萃取溶剂50%的甲醇溶液、乙醇溶液、丙酮溶液的拉曼光谱,曲线(b)、(d)、(f)依次为上述3 种萃取溶剂对应的实际样品溶液的拉曼光谱。

图3 体积分数均为50%的甲醇溶液、乙醇溶液和丙酮溶液以及对应萃取得到的样品溶液的拉曼光谱Fig.3 Raman spectra of 50% methanol,ethanol and acetone solutions,and their respective extracted tobacco sample solutions

由图3可知,当萃取溶剂为50%甲醇溶液时,可以在样品溶液的拉曼光谱图中观察到1 600 cm-1附近目标物的特征峰,而采用其他溶剂时则不能,因此试验选择采用50%甲醇溶液提取实际样品中的目标物。

2.5 预处理方法及建模波段的选择

为了避免噪声和杂散光对目标物响应信号的影响,需对原始拉曼光谱进行预处理,试验选择的预处理方法为SG 平滑法,平滑前后在全波段所建模型的评价结果见表2。

在SG 平滑预处理后,由于绿原酸和芸香苷的特征峰主要集中于1 142.6～1 409.6 cm-1(波段1)和1 555.8～1 652.9 cm-1(波段2)这两个波段,因此试验分别选择在这两个波段内建模,所建模型的评价结果见表2。

表2 光谱预处理前后以及在选择的2个波段内所建模型的评价结果Tab.2 Evaluation results of the model built before and after the spectrum preprocessing and in the selected 2 wavelangth intervals

由表2 可知,经过SG 平滑法预处理后,RMSEC和RMSEP 均趋近于1(绿原酸的RMSEC除外)变大,说明预处理后的模型效果更好;在波段2内建模时较大。因此,试验选择先采用SG 平滑法对原始光谱进行预处理,并在波段2内用PLS建立绿原酸和芸香苷的定量分析模型。

2.6 模型的建立及评价

在优化的试验条件下建模,并对验证集样品进行预测,绘制校正集和预测集样品的预测值和参考值的散点图,并画出校正集样品的拟合线,结果见图4。

图4 校正集和验证集样品中绿原酸和芸香苷的预测值与参考值的关系图Fig.4 Relation figures between the predicted values and the reference values of chlorogenic acid and rutin from calibration samples and validation samples

由图4可知,拟合线和X轴的夹角接近45°,说明模型预测能力较好,并且预测集样品中的绿原酸和芸香苷数据点均分布在拟合线附近,说明所建模型可以准确预测烟草中绿原酸和芸香苷的含量。

本工作以基于拉曼光谱法所建的多元校正定量分析模型预测烟草样品中的绿原酸和芸香苷的含量,所得两种模型的RMSEP 分别为0.88和0.67,分别为0.948和0.970,具有一定的应用价值。