硫酸解交联-考马斯亮蓝法测定医用交联透明质酸钠凝胶中蛋白质的含量

2022-03-02 02:54郭利娟刘爱娟孙兴霞
理化检验-化学分册 2022年2期
关键词:透明质酸钠医用

郭利娟,刘爱娟,孙兴霞,刘 叶,陈 方,沈 永

(1.山东省医疗器械和药品包装检验研究院,济南 250101;2.国家药品监督管理局生物材料器械安全性评价重点实验室,济南 250101;3.山东省医疗器械生物学评价重点实验室,济南 250101)

透明质酸钠是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺通过β-(1-3)糖苷键连接而成的双糖重复结构单元组成的线性黏多糖类化合物[1]。透明质酸广泛分布在人体各部位,被称为理想的天然保湿因子。由于具有优良的生物相容性和填充效果,透明质酸钠被广泛应用于美容整形领域[2-5]。透明质酸钠在进入人体后会被透明质酸酶迅速降解,从而影响其临床使用效果[6-7]。交联透明质酸钠凝胶是透明质酸经交联剂[一般采用1,4-丁二醇二环氧甘油醚(BDDE)]交联修饰得到的具有三维立体结构的高分子凝胶,不仅生物相容性较好,且较透明质酸钠有更长的降解周期,可作为植入性医疗产品,用于鼻唇沟、泪沟、苹果肌、额头等部位的填补[8-11]。

医用交联透明质酸钠凝胶中不仅含有交联透明质酸钠(14~25 g·L-1),还包含添加剂(盐酸利多卡因、游离透明质酸等),属于三类医疗器械用品。其重要原料透明质酸钠的制备方法包括动物组织提取法或微生物发酵法[12]。在制备过程中,可能产生动物源性蛋白质及微生物菌体蛋白质等杂质的残留,如果将这类产品直接注入人体真皮,将会引起排异反应,危害人体健康安全,因此需要对医用透明质酸钠凝胶中蛋白质含量进行监控。

常用的蛋白质含量的测定方法有凯氏定氮法、福林酚法、双缩脲法、2,2′-联喹啉-4,4′-二羧酸法、考马斯亮蓝法、紫外-可见分光光度法等[13]。透明质酸钠中蛋白质含量的测定方法有福林酚法和考马斯亮蓝法,相关标准有YY/T 1571-2017《组织工程医疗器械产品 透明质酸钠》和YY/T 0308-2015《医用透明质酸钠凝胶》,其中福林酚法为常用方法。福林酚法的检测原理:在碱性介质中,蛋白质结构中的肽键会与Cu2+络合形成蛋白质-铜复合物,该复合物可与酚试剂形成蓝色显色体系,同时酚试剂中的磷钨酸-磷钼酸可与蛋白质中含有酚羟基的氨基酸如络氨酸、色氨酸、半胱氨酸反应形成蓝色显色体系,在750 nm 处有最大吸收,在一定条件下,吸光度与蛋白质含量成正比,以此测定蛋白质含量,但该反应体系的干扰因素较多,如还原性物质、其他酚类物质、糖类物质等。考马斯亮蓝法检测原理:在酸性介质中,考马斯亮蓝G-250可与蛋白质中含碱性基团的氨基酸和芳香族氨基酸结合形成显色体系,在595 nm 处有最大吸收,在一定条件下,吸光度与蛋白质含量成正比,以此测定蛋白质含量,该反应体系的干扰因素较福林酚法的少[13]。医用交联透明质酸钠凝胶为高分子聚合物,难溶于水,不能直接采用YY/T 1571-2017和YY/T 0308-2015中所述方法测定,而相关方法还未见报道。

本工作依据YY/T 1571-2017 和YY/T 0308-2015,以牛血清白蛋白作为定量分析的标准品制作标准曲线,用硫酸溶液将医用交联透明质酸钠解交联,对比福林酚法和考马斯亮蓝法测定结果的差异,选择考马斯亮蓝法测定医用交联透明质酸钠凝胶中的蛋白质含量,可为相关产品的质量控制和监管提供方法指导。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

UV-2550 型紫外-可见分光光度计;Milli-Q Advantage A10型超纯水机。

牛血清白蛋白标准储备溶液:102.17 mg·L-1(以纯度折算),取10.32 mg牛血清白蛋白,用水溶解后定容至100 mL容量瓶中。

牛血清白蛋白标准溶液:10.22 mg·L-1,取适量牛血清白蛋白标准储备溶液,用水稀释,配制成10.22 mg·L-1牛血清白蛋白标准溶液。

牛血清白蛋白标准溶液系列:取0,0.20,0.40,0.60,0.80,1.00 mL牛血清白蛋白标准溶液,分别加1.0,0.80,0.60,0.40,0.20,0 mL水,配制成0,2.04,4.09,6.13,8.17,10.22 mg·L-1的牛血清白蛋白标准溶液系列。

考马斯亮蓝G-250 溶液:0.10 g·L-1,取50.13 mg考马斯亮蓝G-250,加入95%(体积分数)乙醇溶液25 mL 和磷酸50 mL,混匀,用水定容至500 mL,并超声使其充分溶解,用滤纸过滤后,滤液备用。

牛血清白蛋白批号为WXBC4547V,纯度为99%;考马斯亮蓝G-250、硫酸为分析纯;试验用水为超纯水;医用交联透明质酸钠凝胶样品来自4个不同厂家。

1.2 试验方法

按质量体积比2∶1(g∶m L)加入医用交联透明质酸钠凝胶样品约0.5 g和0.5 mol·L-1硫酸溶液0.25 mL,密封后置于沸水浴中加热10 min,使其完全溶解。冷却至室温,加入与上述0.5 mol·L-1硫酸溶液等体积的1 mol·L-1氢氧化钠溶液,摇匀后即得供试品溶液。在供试品溶液中加入考马斯亮蓝G-250 溶液5.0 mL,混合均匀后放置10 min,以空白牛血清白蛋白标准溶液为参比,测量上述体系在595 nm 处的吸光度。随同做样品空白试验。

2 结果与讨论

2.1 试验方法的选择

福林酚法和考马斯亮蓝法是测定蛋白质含量的常用方法,将医用交联透明质酸钠凝胶解交联后,分别采用福林酚法(参考YY/T 1571-2017)和考马斯亮蓝法测定,所得结果分别为2089%(福林酚法)和<0.024%(考马斯亮蓝法),两种方法的测定结果差异较大。在对盐酸利多卡因、D-葡萄糖醛酸、N-乙酰基-D-葡萄糖酰胺、3-[4-(2,3-二羟基丙氧基)丁氧基]丙烷-1,2-二醇(BDDE 水解产物)等4种共存杂质进行干扰试验时发现,福林酚法和考马斯亮蓝法所得牛血清白蛋白的回收率分别为932.5%,1006.6%,436.4%,405.6% 和94.1%,93.9%,88.6%,88.0%,说明共存杂质对福林酚法所得结果的干扰极大。这是由于在酸性加热条件下,交联透明质酸钠中的醚键及糖苷键断裂产生的D-葡萄糖醛酸、N-乙酰基-D-葡萄糖酰胺、3-[4-(2,3-二羟基丙氧基)丁氧基]丙烷-1,2-二醇及样品中的添加剂盐酸利多卡因等均可与酚试剂反应显蓝色,从而导致测定结果偏高。基于此,试验选择以考马斯亮蓝法测定医用交联透明质酸钠中蛋白质含量。

2.2 解交联剂种类及其用量、解交联时间的选择

医用交联透明质酸钠凝胶难溶于水,但是在沸水浴加热和酸性条件下,交联透明质酸钠中的醚键可发生水解形成均一溶液,因此试验考察了沸水浴条件下,1 mol·L-1盐酸溶液和0.5 mol·L-1硫酸溶液对交联透明质酸钠解交联效果的影响。取2组样品于样品管中,按照试验方法分别比较了1 mol·L-1盐酸溶液和0.5 mol·L-1硫酸溶液的解交联效果。结果显示,1 mol·L-1盐酸溶液所得吸光度均为负值,这是由于沸水浴条件下,盐酸挥发将会导致样品溶液显碱性,不利于考马斯亮蓝G-250-蛋白质显色体系的稳定,因此试验选择0.5 mol·L-1硫酸溶液作解交联剂。

试验还考察了解交联剂用量分别为0.10,0.15,0.20,0.25,0.30,0.35 mL,解交联时间分别为2,5,8,10 min时对交联透明质酸钠的解交联效果的影响,结果见表1。其中:“×”表示样品管中仍残留有凝胶状样品,说明样品未完全解交联;“√”表示样品管中溶液为澄清透明均一溶液,说明样品解交联完全。

表1 样品解交联条件的选择Tab.1 Selection of sample de-crosslinking conditions

由表1可知:当解交联时间小于8 min,解交联剂用量为0.10~0.35 mL 时,交联透明质酸钠均不能被完全解交联;当解交联时间达到10 min,解交联剂用量不小于0.20 mL 时,交联透明质酸钠均可被完全解交联。综合考虑,试验选择的解交联剂的用量为0.25 mL,解交联时间为10 min。

2.3 标准曲线和检出限

按照试验方法分别测定牛血清白蛋白标准溶液系列,以牛血清白蛋白的质量浓度为横坐标,其对应的吸光度为纵坐标绘制标准曲线。结果显示,考马斯亮蓝法标准曲线的线性范围为2.04~10.22 mg·L-1,线性回归方程为y=8.444×10-3x-6.322×10-3,相关系数为0.997 3。

基于中华人民共和国药典(2020 年版)(Ch P 2020)中9101分析方法验证指导原则[13],按照试验方法重复测定空白样品溶液7次,计算测定值的标准偏差(s),以3.3s与标准曲线斜率(k)的比值计算检出限(3.3s/k),所得检出限为1.353 mg·L-1。

2.4 精密度和回收试验

按照试验方法分析4种医用交联透明质酸钠凝胶,所得蛋白质的质量分数小于0.024%,符合标准YY/T 1571-2017规定的限值(0.1%)要求。选择其中一个阴性样品进行低、中、高等3个浓度水平的加标回收试验(加标物为牛血清白蛋白),每个浓度水平平行测定6次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表2。

表2 精密度和回收试验结果(n=6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n=6)

由表2 可知:蛋白质的回收率为99.3%~100%,RSD 为1.3%~3.5%,均 符合Ch P 2020 中9101分析方法验证指导原则中的指标要求[13]。

本工作提出了硫酸解交联,考马斯亮蓝法测定医用交联透明质酸钠凝胶中蛋白质含量的方法,该方法前处理简单、分析快速、准确度高、精密度好,可用于医用交联透明质酸钠凝胶中蛋白质含量的测定。

猜你喜欢
透明质酸钠医用
玻璃酸钠+rhEGF治疗白内障术后干眼症
透明质酸基纳米纤维促进创面愈合
75%医用酒精
75%医用酒精
溴芬酸钠滴眼液治疗干眼症的临床效果观察
阿仑膦酸钠联用唑来膦酸治疗骨质疏松
关于医学院校医用英语教学的几点思考
医用酒精如何配制
透明质酸酶在透明质酸软组织填充并发症治疗中的应用
透明质酸在化妆品中的应用