胃癌患者血清中miR-373和miR-592的表达变化及意义

黄奕龙，罗强，黄爱茹

1成都市郫都区人民医院胃肠外科，成都 611730；2四川省人民医院康复科

胃癌在全球是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率在恶性肿瘤中排在第五位和第三位，分别约为5.7%和8.2%[1]。在中国，胃癌的发病率排名第三，而病死率却高居第二位[2]。对于中晚期胃癌患者，手术切除加术后放化疗是目前最常用的治疗方案。在过去几十年，尽管早期诊断、外科手术治疗和化疗取得了重大进展，然而胃癌患者仍然具有较高的发病率和病死率[3]。胃癌术后并发症如切口感染、呕吐、术后出血、肠梗阻发生率高，且患者术后短期内无法正常饮食，导致术后住院时间以及恢复时间长，不仅给患者带来极大的痛苦和经济负担，也给临床治疗带来挑战[3-4]。因此，如何早期诊断胃癌一直是临床研究的热点。微小RNA(miRNA)是一类小的非编码RNA，为长度在19～25个核苷酸的内源性保守小分子，主要参与基因转录后调控表达[4]。miRNA的异常表达与包括癌症在内的许多疾病的发病机制有关，对肿瘤细胞的增殖、分化、迁移和凋亡有重要作用[5]。研究表明，miRNA对肿瘤的早期诊断、治疗及预后评估具有一定价值[6]。有研究发现，miR-373和miR-592在胃癌组织中表达上调，并通过不同的信号通路参与胃癌的侵袭转移及发生发展，可能为胃癌的诊断、治疗及预后评估提供重要的策略[7-8]。然而，目前miR-373和miR-592在胃癌患者血清中的研究报道较少。本研究主要探讨胃癌患者血清中miR-373和miR-592的表达变化，并分析其对胃癌的诊断及预后评估的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2014年8月—2016年8月在四川省郫都区人民医院收治的75例胃癌患者(胃癌组)，其中男45例，女30例；年龄37～82(60.59±12.06)岁；既往高血压12例，糖尿病3例；吸烟7例，饮酒12例。纳入标准：年龄≥18岁；首次诊断为胃癌；经病理明确诊断为胃癌；临床及病理资料完整。排除标准：合并其他原发性恶性肿瘤；合并心、脑、肝、肾等慢性病；失访。另外选择同期在我院进行体检的40例健康人作为对照组，其中男25例，女15例；年龄32～72(58.78±9.57)岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义(P均>0.05)。本研究获得四川省郫都区人民医院伦理委员会审核并通过，所有研究对象签署临床研究知情同意书。

1.2 血清中miR-373和miR-592检测 采用RT-PCR。所有患者术前及健康对照空腹采血10 mL，3 000 r/min离心10 min(离心半径10 cm)，取上层血清用于实验。总RNA提取按TRIzol试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)说明书操作步骤操作。采用紫外分光光度法检查RNA浓度和纯度。将RNA反转录为cDNA进行扩增。扩增DNA采用20 μL PCR反应体系。反应条件：95 ℃ 30 min，94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，共40个循环。引物序列由广州锐博生物公司合成。miR-373上游引物序列：5′-TTGTGTCAATATGCGATGATGT-3′，下游引物序列：5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；miR-592上游引物序列：5′-CGCGCGAAGTGCTTCGATTT-3′，下游引物序列：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6上游引物序列：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-373和miR-592相对表达量。

1.3 随访 采用电话回访和门诊复诊相结合方式随访患者预后生存情况，随访截止时间为2020年12月31日。

2 结果

2.1 胃癌组和对照组血清中miR-373、miR-592表达比较 胃癌组、对照组血清中miR-373相对表达量分别为5.34±0.99、3.90±0.64，血清中miR-592相对表达量分别为1.85±0.50、1.07±0.17，两组相比P均<0.01。

2.2 胃癌患者血清中miR-373、miR-592表达与临床病理特征的关系 胃癌患者血清中miR-373、miR-592表达与淋巴结转移和TNM分期有关(P均<0.05)，而与性别、年龄、肿瘤直径、病理分化程度无关，结果见表1。

表1 胃癌患者血清中miR-373、miR-592表达与临床病理特征的关系

2.3 血清中miR-373、miR-592表达对胃癌的诊断价值 ROC曲线分析结果显示，血清中miR-373表达诊断胃癌的曲线下面积为0.904(95%CI：0.845～0.963，P<0.01)，最佳诊断界值为4.93，此时其特异性为0.950，敏感性为0.787。血清中miR-592表达诊断胃癌的曲线下面积为0.941(95%CI：0.900～0.982，P<0.01)，最佳诊断界值为1.24，此时其特异性为0.850，敏感性为0.893。

2.4 血清中miR-373、miR-592表达与胃癌预后的关系 分别以胃癌患者血清中miR-373、miR-592相对表达量中位数值为截断值，将患者分别分为miR-373高表达(43例)、miR-373低表达(32例)和miR-592高表达(47例)、miR-592低表达(28例)。Kaplan-Meier生存曲线结果显示，miR-373低表达者生存率高于miR-373高表达者(P<0.05)；miR-592高表达与miR-592低表达者生存率比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

胃癌作为最常见的恶性肿瘤之一，有早期诊断率低、治疗效果差、晚期病死率高的特点。胃癌患者在早期常没有明显的症状，大部分发现时已处于中晚期。接受过根治性手术的胃癌患者中，有超过一半患者有转移，这类患者的生存期也显著缩短[9]。因此，早期发现胃癌，有助于提高其生存率。目前，临床应用的胃肠道肿瘤相关标志物，主要包括癌胚抗原和糖抗原19-9。但是由于其敏感性较差，不足以用于胃癌的筛查，特别是对早期胃癌的筛查[10]。近年来，miRNA在肿瘤诊断与预后预测中的价值逐渐受到重视，在胃癌基础研究中的报道越来越多，但是临床的实用价值仍缺乏相关探索。

miRNA广泛参与肿瘤的发生、发展和侵袭转移过程，这提示miRNA可能作为肿瘤的诊断标志物或潜在的治疗靶点[11]。miRNA常通过与靶mRNA的3′-UTR结合，在转录后水平上调控基因的表达，从而降解基因或抑制基因翻译。miR-21是目前被广泛研究的一个致癌的miRNA，在膀胱癌[12]、结肠直肠癌[13]、非小细胞肺癌[14]和胃癌[15]的侵袭和转移中发挥促进作用。在胃癌中，miR-21通过靶向调控PTEN的表达促进肿瘤细胞生长和侵袭[16]。此外，有研究发现，miR-373和miR-592在多种恶性肿瘤中表达上调，并通过不同信号通路参与肿瘤的侵袭和转移[7,17]。

研究发现，与健康人相比，miR-373-3p在胰腺癌患者组织和血清样本中的表达下调，且miR-373-3p低表达也与预后不良的临床特征有关[18]。但也有研究表明，miR-373-3p的上调与肿瘤的早期进展有关。该研究显示，miR-373-3p在正常的腺泡细胞中有表达，在胰腺导管腺癌(PDAC)细胞中高表达，而在PDAC肿瘤的最大成分肿瘤间质中没有表达[19]。miR-373表达的差异可能在于患者群体之间的差异。且miR-373-3p在癌症中的作用方式尚不明确。在一些癌症中，这种miR-373-3p被描述为肿瘤抑制因子，如在肝门周围胆管癌中；而在其他癌症中，miR-373则显示出促进肿瘤的特性，如在肝细胞癌和乳腺癌中[20]。目前，已有许多基因已被确定为miR-373-3p的靶点，根据miRNA靶点数据库(MiRDB)，miR-373-3p有899个预测的基因靶点，其中前两个是YOD1和LATS2。YOD1和LATS2是调控细胞周期基因，但LATS2也是p53途径的调节因子[21-22]。从PDAC的角度来看，miR-373最有趣的功能之一是它与致癌的RAS协同作用，克服了癌细胞增殖所需的p53丢失。正常情况下，p53对RAS诱导的肿瘤发生有抗增殖反应。然而，miR-373的表达使p53失活，从而绕过了衰老机制[23]。这些研究证明miR-373-3p可能通过多种机制发挥调控肿瘤的作用，尤其是通过调控细胞周期与p53发挥作用，同时与肿瘤的特异性有关系。本研究结果表明，胃癌患者血清中miR-373表达升高，提示miR-373可能发挥促进胃癌进展的作用。进一步将血清中miR-373的表达与患者临床病理特征进行分析发现，miR-373的表达越高，患者的胃癌分期越晚，分化越差。生存分析结果证实，miR-373高表达提示患者不良的预后与较短的生存期。这表明，在胃癌中，miR-373可能发挥促进肿瘤进展的作用。既往研究发现，miR-373在胃癌组织和胃癌细胞中表达上调，主要通过下调TNFAIP1的表达促进胃癌细胞株GES-1的迁移和侵袭[24]。miR-373在胃癌中的具体机制仍需进一步研究。

血清miR-592是一种肿瘤源性miRNA。miR-592的生物学效应已在多种恶性肿瘤中被报道，包括乳腺癌、胃癌和非小细胞肺癌。然而，miR-592是否扮演癌基因或肿瘤抑制因子的角色取决于肿瘤微环境[25-26]。miR-592在胶质瘤中显著下调，通过调节Rho相关蛋白激酶抑制胶质瘤的发展。miR-592在大肠癌中作为癌基因发挥作用，上调与大肠癌患者的不良预后相关[27]。一项独立队列研究表明，血清miR-592可用于区分大肠癌患者的分期，具有较高的诊断价值，miR-592表达越高，大肠癌患者的分期越晚。此外，研究表明大肠癌组织中miR-592的失调与大肠癌患者的不良预后相关，并且血清miR-592升高被证明是肿瘤源性的，因此血清miR-592可能具有以无创方式预测大肠癌患者预后的能力[28]。结肠癌与胃癌均是胃肠的常见肿瘤，推测miR-592在胃癌中亦可能存在相同的价值。同时，体外研究已经证实，miR-592在胃癌中上调，促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，其机制是通过靶向调控磷酸肌醇3-激酶/AKT和丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶信号通路诱导内皮细胞向间充质细胞转化[29]。本研究结果表明，胃癌患者血清中miR-592表达升高，提示miR-592可能发挥促进胃癌进展的作用。进一步将血清中miR-592的表达与患者临床病理特征进行分析发现，miR-592的表达越高，患者的胃癌分期越晚，分化越差。但是，随访的生存分析结果表明miR-592的高表达与预后不存在显著的关系，这亦提示miR-592可能在胃癌中不发挥核心调控作用。但是仅基于临床结果的上述结果仍需要进一步的多中心及基础研究进行证实。

本研究还发现血清miR-373和miR-592诊断胃癌时ROC的曲线下面积分别为0.904和0.941，提示miR-373和miR-592对胃癌具有较高的诊断价值，可作为血清标志物筛查胃癌。

综上所述，本研究结果提示胃癌患者血清中miR-373和miR-592表达升高，可能与胃癌的转移相关，同时对胃癌的诊断也具有一定的价值。此外miR-373高表达与胃癌的生存期相关，可能作为患者不良预后生存的标志物。