MLPA技术在α-珠蛋白生成障碍性贫血罕见基因型患者及家系分析中的应用*

刘发娣，卢 娟，周红平，王 珂，胡 蓉，柯江维△

1.江西省儿童医院检验科，江西南昌 330006；2.南昌大学医学部基础医学院，江西南昌 330006

α-珠蛋白生成障碍性贫血(简称地贫)是人类常见的单基因遗传病之一[1]，临床以小细胞低色素性贫血为主要表现，临床表型包括几乎无症状的携带者至致死性溶血性贫血患者[2]。α-地贫主要分布在热带和亚热带地区，在中国，则以广西、广东、福建、江西、四川和海南为主，地域性强[3-8]。α-地贫是由于编码珠蛋白α链的α-珠蛋白基因簇出现片段缺失或(和)点突变而引起，该基因簇位于人类染色体16p13.3，健康人每条16号染色体均有两个α-珠蛋白基因。α-地贫患者的临床表型与受累的α-珠蛋白基因个数直接相关，当一条染色体中两个α-珠蛋白基因均失活时，为α0-地贫；而一条染色体中任意失活一个α-珠蛋白基因则称为α+-地贫；两条染色体仅失活一个α-珠蛋白基因的携带者往往表现为没有临床症状的静止型；而失活两个α-珠蛋白基因的患者主要表现为轻度贫血；若4个α-珠蛋白基因中有3个基因受累则表现为血红蛋白H病；4个α-珠蛋白基因全部受累表现为Hb Bart′s胎儿水肿综合征。

目前，珠蛋白基因检测最常用的方法是跨越断裂点聚合酶链反应(Gap-PCR)和反向斑点杂交技术。在我国，引起α-地贫的突变类型包括缺失型突变和点突变，--SEA是最常见的缺失突变类型，其次为-α3.7和-α4.2；而点突变则以αQS(Hb Quong Sze)、αCS(Hb Constant Spring)和αWS(Hb Westmead)为主。本文将阐述运用多重连接探针扩增(MLPA)技术对α-珠蛋白基因罕见的27.6 kb大片段缺失突变家系的检测分析过程，而该突变为首次在江西籍人群中被发现并报道。

1 资料与方法

1.1一般资料 先证者，男，5岁9个月，江西景德镇人，因发现贫血1年半来江西省儿童医院就诊。入院时，贫血面容，皮肤无黄染，口唇淡红，口腔黏膜正常，未触及肝脾肿大。患儿父亲既往体健，系退伍军人，无贫血症状。患儿母亲贫血面容，怀孕期间曾3次晕倒。患儿有两个姐姐，均体健，无贫血表现。

1.2方法

1.2.1标本采集与血液学分析 采集患儿及其家系成员外周血2 mL(EDTA-K2抗凝)，红细胞相关参数分析采用血细胞分析仪(XN-1000，日本Sysmex公司)；血红蛋白电泳及组分定量分析采用快速自动电泳分析系统(Capillarys Sebia-2,法国Sebia公司)。外周血基因组DNA提取采用外周血DNA提取试剂盒(广东凯普生物技术有限公司)。

1.2.2反向斑点杂交 试验采用广东凯普生物技术有限公司的地贫检测试剂盒(含α-地贫常见缺失突变、α-地贫常见点突变和β-地贫的常见点突变)，严格按照说明书操作。

1.2.3MLPA 采用P140-C1 HBA试剂(MRC-HOLLAND，荷兰)，委托中翰金诺医学检验所进行检测。

1.2.4Gap-PCR 根据MLPA检测结果，参考文献[9]，委托上海捷瑞生物公司合成引物(F:5′-ATCTGAGGTGGCACACAAGCA-3′；R:5′-AGCCCCAA GTCATGGACTCAC-3)，运用Gap-PCR对患者及其家系成员进行扩增，引物水平为10 μmol/L，扩增体系为20 μL：其中2×PCR mix 10 μL，引物F 1 μL，引物R 1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 6 μL。扩增反应条件：95 ℃，3 min，1个循环；95 ℃ 50 s，62 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，同时将先证者PCR产物送广东凯普生物技术有限公司进行基因测序。

2 结 果

2.1血液学分析 先证者及其家系成员的地贫筛查血液学指标如表1所示，先证者及其母亲平均红细胞体积(MCV)和平均红细胞血红蛋白量(MCH)均显著降低，为典型的小细胞低色素性贫血，且血红蛋白A2(HbA2)均偏低，提示先证者及其母亲可能是α-珠蛋白基因突变携带者；而先证者父亲及其两个姐姐血液学指标未见明显异常。

表1 先证者及其家系成员的血液学和生化参数

2.2反向斑点杂交 如图1所示，先证者α-地贫缺失突变对照点NP和点突变的正常对照点均未显示，先证者父亲未见常见的α-地贫缺失突变和点突变，先证者携带的--SEA缺失突变来源于母亲，而先证者两个姐姐的反向斑点杂交结果均未见异常。

图1 反向斑点杂交法膜条探针排列顺序及先证者家系成员检测结果

2.3MLPA检测结果 先证者样本自346 nt探针至400 nt探针处均出现不同程度缺失，该缺失区域包含HBZ、HBZP1、HBAP2、HBAP1、HBA2、HBA1及HBQ1基因。根据试剂说明书可知184 nt探针至400 nt探针缺失为--SEA，包含HBAP1、HBA2、HBA1及HBQ1基因，而346 nt探针至337 nt探针缺失为-α27.6。见图2。

注：A为MLPA技术检测HBA基因的探针分布位置，灰色横条代表- -SEA缺失的范围(探针184～400 nt)，黑色横条代表-α27.6缺失的范围(探针346～337 nt)；B为先证者不同探针位置的拷贝数比值，其中比值在0.7～1.3为拷贝数正常，0.3～<0.7为杂合缺失，比值为0则是纯合缺失，比值>1.3代表重复。

2.4Gap-PCR和基因测序结果 根据MLPA结果，于-α27.6缺失的两侧设计引物，通过Gap-PCR扩增，将产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，如图3所示，1、2、5这3个泳道可见约1.7 kb的特异性条带，分别是先证者及其父亲和姐姐(小)；而3、4泳道显示，先证者母亲和姐姐(大)未携带该缺失突变。为了进一步明确患者的基因缺失位置，采用Sanger测序对Gap-PCR扩增产物进行测序，结果见图4，缺失的范围位于NG_000006.1:9079与NG_000006.1:36718之间，同时，两个断点之间还插入了AATCCC 6个碱基。

注：M为标志物；1为先证者；2为父亲；3为母亲；4为姐姐(大)；5为姐姐(小)；1.7 kb条带为-α27.6缺失的特异性条带。

注：缺失范围见图中标识，缺失碱基T与A之间插入了6个碱基。

3 讨 论

α-地贫为最常见的常染色体隐性遗传病，随着基因检测和诊断技术的不断进步，越来越多罕见的α-地贫突变类型不断被发现。目前，检测α-地贫缺失突变最常用的方法是Gap-PCR[10]，结合琼脂糖凝胶电泳或者反向斑点杂交实验共同完成。临床推广的检测试剂主要包括α-地贫的3种常见缺失类型和3种常见的点突变类型，涵盖了国内约98%的α-地贫类型[11]。本文中的先证者在常规斑点杂交实验中显示，除了携带--SEA外，缺失突变的正常对照点以及3个点突变的正常对照点均没有显色，由于本实验室所使用的检测试剂中，α-缺失突变的正常对照点的同源序列来自α2基因，而3种常见的点突变也存在于α2基因中，因此，可以推测患者出现的罕见斑点杂交图是因为患者一条染色体携带了--SEA缺失，而另一条染色体可能缺失了α2基因。

为了明确患儿所携带的α-珠蛋白基因突变型，本文选用MLPA技术进行检测，MLPA技术是2002年由SCHOUTEN等[12]首先报道，该方法结合了DNA探针杂交和PCR扩增技术，可对待检DNA序列进行定性和半定量分析，1次反应可检测45个靶序列，适用于基因片段缺失或重复以及已知点突变的检测，用于检测已知与未知的大片段缺失型α-珠蛋白基因。MLPA技术检测结果显示，先证者所携带的是一种罕见的-α27.6缺失突变。

跨过-α27.6缺失范围，在两侧设计引物，通过Gap-PCR可成功扩增出特异性条带。根据该家系的电泳结果可以看出，先证者的-α27.6缺失突变来自父亲，先证者的姐姐(小)也携带了该突变。通过对Gap-PCR产物进行Sanger测序，可准确判定缺失基因的断点，将测序结果与NCBI GeneBank比对后发现，该家系的缺失突变与此前报道的多个携带者为同一突变类型[9,13-14]。尽管目前有多篇研究报道了-α27.6缺失基因型携带者或家系，但患者均来自中国福建省[9,13-14]。本文的患者为江西省景德镇人，是江西省首次检测到该突变的携带者，丰富了江西省地贫疾病突变谱，同时也为罕见α-地贫的基因诊断方法提供参考。

不同的突变类型导致患者贫血的临床表型和机制可能不同[15]，本文中先证者的父亲虽然也是-α27.6缺失基因型携带者，但他没有血液学异常的表现，并且常规临床检测试剂又未能包含该缺失类型，因此，对于地贫的罕见基因型的发现与诊断，家系分析就显得尤为重要。自从20世纪80年代开始，我国严格执行计划生育政策后，大量独生子女的出现导致大家系明显减少，也使得此类罕见型突变的发现更加困难。就本文所研究的家系而言，患儿父母虽然同时携带α-珠蛋白基因缺失突变，但是只有患儿同时遗传了父母双方的地贫缺陷基因时，才会在常规筛查实验中表现出异常的斑点杂交图，而下一代中同时携带父亲和母亲两种缺陷基因的概率仅为25%。事实也正如此，该患儿为家系中的第3个孩子，姐姐(大)珠蛋白基因未见异常，姐姐(小)则携带了与其父亲一样的罕见缺失突变，若没有先证者的出生，那么该家系所携带的27.6 kb缺失突变也难以被发现。这可能是-α27.6缺失突变携带者罕见的原因之一。因此，笔者认为-α27.6缺失突变的人群携带率可能远比实际发现的高。

综上所述，对于罕见的α-地贫突变类型，特别是尚未报道的缺失突变类型，MLPA技术是一个良好的检测手段。因此，当临床发现可疑大片段缺失的地贫患者时，可先选择MLPA技术对α-珠蛋白基因进行检测，寻找可能出现缺失的部位，再针对基因缺失部位的两端设计引物，进行Gap-PCR扩增和基因测序，便可进一步明确患者的基因型[9,16]。但是对于该家系先证者缺失了3个α基因，却没有血红蛋白H带(HbH)这一现象，虽然有文献[17]谈及，但具体的机制还不明确，还需要进一步研究探讨。