枸橘苷对人骨肉瘤U-2 OS 细胞的抑制作用*

唐 捷，张丕军，林 维，李超艺

（海南医学院第二附属医院骨科二区，海南 海口 570311）

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与细胞

仪器：Thermo HERA cell 150i型细胞培养箱、7500型反转录聚合酶链反应仪（美国Thermo Fisher Scientific公司），Read Max 1900 plus 型酶标仪（上海闪谱生物科技有限公司）；DS-500 型微量分光光度计（屹谱仪器制造＜上海＞有限公司）；PowerPac Universa1 型电泳仪（美国Bio - Rad 公司）；Tanon 4800 型化学发光成像仪（上海天能科技有限公司）；MF43-M 型显微镜（广州市明美光电技术有限公司）。

试药：枸橘苷（成都仪睿生物科技有限公司，批号为DG0073，含量≥98%）；CCK- 8 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号为C0037）；FBXO2过表达载体（pLVX - EGFP - C1 - FBXO2）和阴性对照（pLVX -EGFP-C1，NC）及两者对应的慢病毒包装（汉恒生物科技＜上海＞有限公司）；Trizol 试剂（美国Thermo Fisher Scientific 公司，批号为15536749）；2 × SYBR Green qP‐CR Master Mix（美国Bimake 公司，批号为B21202）；FBXO2 抗体（批号为ab133717）、LC3B 抗体（批号为ab192890）、Beclin1 抗体（批号为ab210498）、p62 抗体（批号为ab109012），均购自英国Abcam公司；p-STAT3抗体（批号为4074s）、STAT3 抗体（批号为9139s），均购自美国Cell Signaling Technology 公司；GAPDH 抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，批号为10494-1-AP）；超敏ECL 化学发光工作液（上海翊圣生物科技有限公司，批号为36208ES60）。

细胞：人骨肉瘤细胞株U - 2 OS（上海继和生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

U - 2 OS 细胞用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640 培养基，于37 ℃及5% CO2培养箱中培养。待细胞密度为80%～90%时，用胰酶液消化细胞，以含10%FBS 的RPMI 1640 培养基重悬细胞，按1∶3 比例传代培养。

1.2.2 枸橘苷对U-2 OS 细胞的半数抑制浓度（IC50）

收集不良反应监测数据库中我院2016-2017年89位患者在接受121例/次化疗过程中所出现的Ⅳ度骨髓抑制不良反应病例，化疗前患者血象正常，且KPS评分在70分及以上。收集统计患者的一般情况、肿瘤类型、化疗方案及治疗方案的临床用药问题数据资料，分析骨髓抑制的发生特点、相关影响因素及用药合理性。根据世界卫生组织（WHO）分度标准，血红蛋白＜65g/L，或白细胞计数＜1.0×109L－1或绝对中性粒细胞计数＜0.5×109L－1，或血小板计数＜25×109L－1为化疗所致毒性反应分级的Ⅳ度骨髓抑制。患者既往治疗历史见表1。

取对数生长期的U - 2 OS 细胞，接种至96 孔板中（5×103个/孔），于37 ℃及5% CO2培养箱中继续培养24 h。将细胞分为枸橘苷①组、②组、③组、④组、⑤组、⑥组、⑦组（分别予枸橘苷0，5，10，20，40，80，160 μmol/L），每组设3个复孔。另设空白组，仅有培养基和枸橘苷溶液。每孔加入相应药液继续培养24 h，再加入10 μL CCK-8反应液，37 ℃孵育4 h后，检测450 nm波长处的吸光度（OD），平行操作3 次。细胞活力（%）=（OD枸橘苷组-OD空白组）/（OD枸橘苷①组-OD空白组）×100%，以GraphPad Prism 5.0软件计算枸橘苷对U-2 OS细胞的IC50。

1.2.3 U-2 OS 细胞实验

分组：分为空白对照组［等体积磷酸盐缓冲液（PBS）］和枸橘苷低、高剂量组（26 μmol/L和52 μmol/L）。

细胞活力：采用CCK - 8 法检测。取对数期生长的U - 2 OS 细胞，接种至96 孔板中（5 × 103个/ 孔），于37 ℃及5% CO2培养箱中分别培养0，24，48，72 h；每孔加入10 μL CCK-8 反应液，37 ℃培养箱中孵育4 h，检测各孔在450 nm波长处的OD。每组设3个复孔，实验重复3次。

细胞增殖：采用集落形成实验。取对数生长期的U- 2 OS 细胞，接种至24 孔板中（300 个/ 孔），于37 ℃及5% CO2培养箱中连续培养2 周。弃去培养基，以4%多聚甲醛固定细胞，用0.1%结晶紫染液染色1 h，以流水缓慢洗去染液，室温下干燥。记录各组细胞克隆形成数。

FBXO2 mRNA 表达水平：采用反转录聚合酶链反应（RT - PCR）法。收集转染后的U - 2 OS 细胞，采用Trizol 法提取总RNA。采用微量分光光度计测定RNA的浓度，并反转录制备cDNA。引物序列，FBXO2，上游（5′ - 3′）ACTTGGAAGGCTGGTGTGAC，下游（5′ - 3′）TCAAAGGAGGAGGCGAAGTA；GAPDH，上游（5′ - 3′）GGGAAGGTGAAGGTCGGAGT，下游（5′ - 3′）GGGGT‐CATTGATGGCAACA。反应程序，95 ℃、5 min；95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，40 个循环；95 ℃、15 s；60 ℃、60 s；95 ℃、15 s。以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCt法计算FBXO2 mRNA的相对表达水平。

细胞中FBXO2，LC3Ⅰ，LC3Ⅱ，Beclin 1，p62，p -STAT3，STAT3蛋白表达水平：采用Western blot法。收集U-2 OS细胞，以RIPA裂解液裂解细胞。4 ℃、12 000 r /min离心20 min，取上清液，采用BCA 法检测蛋白含量。取30 μg 上样，10%SDS-PAGE 电泳后电转。以封闭液室温封闭2 h，加入FBXO2（1∶1 000，V/V），LC3B（1∶1 000，V/V），Beclin1（1∶1 000，V/V），p62（1∶1 000，V/V），p - STAT3（1∶2 000，V/V），STAT3（1∶2 000，V/V），GAPDH（1∶5 000，V/V）抗体，4 ℃孵育过夜。以辣根过氧化物酶标记二抗（1∶2 000，V/V）室温孵育1 h。加超敏ECL化学发光工作液，采用化学发光成像仪检测蛋白条带。通过Image J软件将条带灰度值数字化，目的条带与内参条带灰度比值为各目的蛋白的相对表达水平。

1.2.4 慢病毒转染细胞实验

分组：分为枸橘苷组（A组）、空白对照组（B组）、枸橘苷对照组（C 组，52 μmol / L）、枸橘苷+ FBXO2 组（D 组，52 μmol/L）。A 组仅加入枸橘苷（52 μmol/L）及相应培养基；B组仅加入等体积PBS及相应培养基。

慢病毒转染：取对数生长期的U-2 OS 细胞，接种至96 孔板中（4×105个/孔），于37 ℃及5%CO2培养箱中培养48 h；弃去旧培养基，加入含5 μg/mL polybrene和2% FBS 的RPMI 1640 培养基，C 组加入50 MOI NC（pLVX-EGFP-C1），D组加入50 MOI FBXO2（pLVXEGFP - C1 - FBXO2），B 组加入等体积PBS，4 组均培养48 h；弃去旧培养基，更换含10% FBS 的RPMI 1640培养基，各孔加入相应药液，继续培养48 h。

检测指标及方法：同1.2.3项。

1.3 统计学处理

采用SPSS 21.0 统计学软件分析。计量资料以±s表示，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 U-2 OS 细胞实验

IC50实验结果显示，枸橘苷对U - 2 OS 细胞的IC50为52.08 μmol/ L。故后续实验中枸橘苷对U - 2 OS 细胞的抑制浓度选用为26，52 μmol/L。

细胞活力和增殖：与空白对照组比较，枸橘苷低、高剂量组U-2 OS 细胞在24，48，72 h 时的细胞活力显著减弱，克隆形成数显著减少（P＜0.05）。详见图1。

细胞自噬：与空白对照组比较，枸橘苷低、高剂量组U-2 OS细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05），p62 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。详见图2。

细胞中FBXO2 表达和STAT3 通路：与空白对照组比较，枸橘苷低、高剂量组U - 2 OS 细胞中FBXO2 mRNA 和蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），p -STAT3/STAT3显著降低（P＜0.05）。详见图3。

2.2 慢病毒转染细胞实验

细胞活力和增殖：与B 组比较，A 组U - 2 OS 细胞在培养24，48，72 h 时活力显著减弱（P＜0.05），克隆形成数显著减少（P＜0.05）；与C 组比较，D 组U-2 OS细胞在24，48，72 h 时的细胞活力显著增强（P＜0.05），克隆形成数显著增加（P＜0.05）。详见图4。

细胞中FBXO2 mRNA 和蛋白表达：与B 组比较，A 组U-2 OS 细胞中FBXO2 mRNA 和蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与C 组比较，D 组U - 2 OS 细胞中FBXO2 mRNA 和蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）。详见图5。

细胞自噬：与B 组比较，A 组U - 2 OS 细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05），p62 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与C 组比较，D 组U-2 OS 细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1 蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05），p62 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。详见图6。

a.显微镜视野 b.统计数据A.细胞活力 B.细胞增殖注：与空白对照组比较，*P ＜0.05。图2、图3同。图1 枸橘苷对U-2 OS细胞活力和增殖的影响a.Field of microscope b.Statistical dataA.Cell viability B.Cell proliferationNote：Compared with those in the blank control group，*P ＜0.05（for Fig.1-3）.Fig.1 Effect of poncirin on the viability and proliferation of U-2 OS cells

1.空白对照组 2.枸橘苷低剂量组 3.枸橘苷高剂量组A.电泳图 B.LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ C.Beclin1、p62蛋白表达图2 枸橘苷对U-2 OS细胞自噬的影响1.Blank control group 2.Poncirin low-dose group 3.Poncirin high - dose groupA.Electrophoretogram B.LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ C.Expression of Beclin1 and p62 proteinFig.2 Effect of poncirin on the autophagy of U-2 OS cells

1.空白对照组 2.枸橘苷低剂量组 3.枸橘苷高剂量组B1，C1.电泳图 B2，C2.统计数据A.FBXO2 mRNA表达 B.FBXO2蛋白表达 C.p - STAT3 / STAT3图3 枸橘苷对U-2 OS细胞FBXO2表达和STAT3通路的影响1.Blank control group 2.Poncirin low-dose group 3.Poncirin high-dose groupB1，C1.Electrophoretogram B2，C2.Statistical dataA.Expression of FBXO2 mRNA B.Expression of FBXO2 protein C.p-STAT3/STAT3Fig.3 Effect of poncirin on the FBXO2 expression and STAT3 pathway in U-2 OS cells

慢病毒转染细胞STAT3 通路：与B 组比较，A 组U-2 OS细胞中p-STAT3/ STAT3显著降低（P＜0.05）；与C 组比较，D 组U-2 OS 细胞中p-STAT3/STAT3 显著升高（P＜0.05）。详见图7。

3 讨论

骨肉瘤是原发性骨癌的一种高分级形式，约20%的患者诊断时发现已转移［7］。现临床采用手术切除原发性肿瘤联合化疗，但约1/3的患者出现转移性疾病［8］。

类黄酮属多酚类化合物，包括黄烷酮类、黄烷醇类、花青素类、原花青素类、异黄酮类等成分［9］。枸橘苷属富含黄烷酮的苷类物质，可通过介导胃癌细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用［10］。此外，枸橘苷可增强顺铂耐药骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性，促进细胞凋亡［11］。自噬在肿瘤细胞迁移和侵袭、肿瘤干细胞维持、治疗抵抗及肿瘤细胞与其微环境之间的交互作用中发挥了关键作用［12］。有研究表明，虎杖苷可显著抑制骨肉瘤细胞的增殖，增加其自噬通量；暴露于自噬抑制剂3- 甲基腺嘌呤后，虎杖苷诱导的细胞自噬显著减弱，而细胞存活率升高［13］。本研究结果显示，枸橘苷可抑制U-2 OS 细胞增殖，提高U-2 OS 细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1 蛋白的表达水平，抑制p62 蛋白表达水平的升高，提示枸橘苷可抑制U-2 OS细胞增殖并诱导细胞自噬。

b1.电泳图 b2.统计数据a.FBXO2 mRNA表达 b.FBXO2蛋白表达图5 U-2 OS细胞中FBXO2的表达b1.Electrophoretogram b2.Statistical dataa.Expression of FBXO2 mRNA b.Expression of FBXO2 proteinFig.5 Expression of FBXO2 in U-2 OS cells

a.显微镜视野 b.细胞克隆统计 c.细胞活力图4 过表达FBXO2逆转枸橘苷对U-2 OS细胞增殖的影响注：与B组比较，*P ＜0.05；与C组比较，#P ＜0.05。图5至图7同。a.Field of microscope b.Statistics data of clone cells c.Cell viabilityFig.4 Effect of poncirin on the proliferation of U-2 OS cells by the overexpression of FBXO2 reversesNote：Compared with those in group B，*P ＜0.05（for Fig.4-7）；Compared with those in group C，#P ＜0.05（for Fig.4-7）.

大多数F-box 蛋白通过调控参与肿瘤标志性途径底物的表达，促进肿瘤细胞的生长、增殖、进展、转移和侵袭［14］。FBXO2 属F - box 蛋白家族，其高表达与大肠癌转移和大肠癌细胞分期密切相关，是大肠癌患者的独立预后因素［15］。在子宫内膜癌中，FBXO2表达的增强与肿瘤分期、肿瘤分级、肿瘤组织学类型及预后不良有关［16］。本研究结果显示，枸橘苷可抑制FBXO2 的表达，提示枸橘苷可通过抑制FBXO2 的表达而抑制U-2 OS细胞的增殖，并诱导其自噬。

STATs是信号传感器和转录激活因子，配体依赖的STATs 调节级联激活，通常与细胞生长、分化的调节有关［17］。STAT 家族成员STAT3 信号通路能调节肿瘤细胞的增殖、生长和凋亡［18］。目前已有研究证明，可通过诱导细胞自噬抑制STAT3磷酸化，从而抑制脑肿瘤细胞的生长，并促进其凋亡［19］，激活STAT3 通路可促进U-2 OS细胞的增殖和转移［20］。FBXO2 可通过激活STAT3 通路促进U-2 OS 细胞增殖［21］。本研究结果显示，枸橘苷可抑制U-2 OS细胞中STAT3的磷酸化，提示枸橘苷可通过抑制FBXO2 表达而抑制STAT3 通路的激活，从而在骨肉瘤细胞中发挥抑制作用。

综上所述，枸橘苷可抑制U-2 OS 细胞增殖，并促进其自噬，其机制可能与抑制FBXO2 表达从而抑制STAT3通路激活有关。

a.电泳图 b.LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ c.Beclin1，p62蛋白表达图6 过表达FBXO2逆转枸橘苷对U-2 OS细胞自噬的影响a.Electrophoretogram b.LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰc.Expression of Beclin1 and p62 proteinsFig.6 Effect of poncirin on the autophagy of U-2 OS cells by the overexpression of FBXO2 reverses

a.电泳图 b.p - STAT3 / STAT3图7 过表达FBXO2逆转枸橘苷对骨肉瘤细胞STAT3通路的影响a.Electrophoretogram b.p-STAT3/STAT3Fig.7 Effect of poncirin on the STAT3 pathway of osteosarcoma cells by the overexpression of FBXO2 reverses