Beclin-1、LC3和mTOR在肺癌中的表达及意义

王婧喆，王翠峰

(1.内蒙古科技大学包头医学院研究生学院，内蒙古 包头 014010；2.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院检验科)

肺癌(Lung cancer,LC) 多原发于气管、支气管和肺，是我国常见的、发病率和病死率最高的恶性肿瘤[1]，对人类健康造成巨大威胁。胸腔积液是胸膜腔内的病理性液体积聚[2]，当肺部发生癌性病变时可产生恶性胸腔积液(malignant pleural effusion,MPE)。MPE是肺癌患者的常见并发症，对患者的生活质量产生较大影响。有研究表明，诊断为MPE的患者总生存期(Overall survival,OS)仅为3～12个月[3]。因此，快速而准确地鉴别胸腔积液性质对临床诊断及精准治疗尤为重要。有研究发现细胞自噬现象在恶性肿瘤的发生发展中具有重要作用，而Beclin-1、LC3和mTOR是自噬过程中的三种关键蛋白。

自噬是一种古老且进化上相对保守的细胞分解代谢途径[4]。正常情况下，机体通过一定水平的基础自噬将细胞内受损的细胞器、折叠错误的蛋白质等进行降解[5]，以满足细胞的代谢需求并维持机体的稳态。而自噬活性的异常改变与肿瘤细胞的生长迁移具有重要的关系。

Beclin-1是一种在发育过程中必不可少的肿瘤抑制基因,也是自噬小体形成过程中必不可少的元件，在调控细胞自噬活性方面具有重要作用[6]。LC3参与自噬小体的形成并定位于自噬体膜上，其含量与自噬泡的数量呈正比[7]，可以间接反映细胞自噬水平的程度。mTOR在自噬过程中发挥门控的作用，其活性是自噬体形成、成熟的关键[8]。

本研究选取了同一时期肺癌引起的恶性胸腔积液标本和良性胸腔积液标本作为研究对象，运用实时荧光定量PCR和Western-blot技术检测Beclin-1、LC3和mTOR三种物质的表达情况，通过观察它们在两组标本中的表达含量，探讨自噬与肺癌发生发展的关系。

1 对象与方法

1.1实验材料

1.1.1实验对象 选取内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院2018年—2019年间住院患者良性和肺癌引起恶性胸腔积液标本各30例，作为对照组和实验组，年龄为34～82(60.2±12.8)岁。患者均知晓此研究并已签署知情同意书，此研究已经通过医院医学伦理委员会审核同意。

1.1.2纳入标准 (1)患者经影像学检查确诊为胸腔积液；(2)经液基薄层细胞学和病理学检查明确由肺癌引起的恶性积液标本。

1.1.3排除标准 (1)诊断不明的胸腔积液标本；(2)合并多种疾病的胸腔积液标本；(3)妊娠期及哺乳期妇女；(4)存在语言障碍，无法配合的患者。

1.1.4实验试剂 液基薄层细胞学试剂(湖北德里森科技有限公司提)；瑞-吉染液(中国珠海贝索公司)；PCR提取试剂盒(天根生化科技北京有限公司)；实时荧光定量PCR试剂盒(北京宝日医生物技术有限公司)；Beclin-1、LC3及mTOR特异性引物(北京瀚海拓新生物技术有限公司)；HRP标记山羊抗兔IgG、LC3、Beclin-1、mTOR兔多克隆抗体、Western blot蛋白质提取试剂盒及BCA蛋白含量检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。

1.2实验方法

1.2.1实验前处理 采集胸腔积液标本分装于5支洁净试管中，离心5 min，弃上清留沉淀并编号。其中3管置于4 ℃低温冰箱保存(时间最好不超过8 h)，用于液基薄层细胞学涂片检查；另外2管置于-80 ℃超低温冰箱，用作后续实时荧光定量PCR检查及Western blot实验。

1.2.2液基薄层细胞学涂片检查 将胸腔积液标本用全自动液基细胞仪制成薄层细胞涂片，干燥后行瑞-吉染色15 min，活水冲洗、晾干后行显微镜检查。并向两位资历及经验丰富的检验医师请教，根据染色情况、显微镜下细胞形态以及患者临床相关病历资料做出诊断，共选取30例良性胸腔积液标本和30例肺癌引起的恶性胸腔积液标本作为研究对象。

1.2.3实时荧光定量PCR 将胸腔积液标本复融，混匀并编号，于冰上备用。按照试剂盒说明书提取细胞总RNA，使用分光光度仪检测样本RNA浓度。在37 ℃,15 min、85 ℃,5 sec、4℃,10 min条件下逆转录成cDNA。采用TB Green嵌合荧光法进行PCR反应，20 μL反应体系液按照TaKaRa说明书配制，在50 ℃,2 min、95 ℃,1 min、95 ℃,15 sec、59 ℃,30 sec、74 ℃,30 sec、72 ℃,2 min条件下扩增，共40个循环。选择β-actin 作为内参照，每个样本进行三次独立重复实验，结果取其平均值。引物序列如表1所示：

表1 实时荧光定量PCR引物序列

1.2.4Western blot 于冰上提取相应的组织蛋白质，检测蛋白质浓度后上样。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质分离，PVDF转膜1.5 h (mTOR蛋白分子量较大，转膜时间调整为4 h)。随后5 %脱脂奶粉封闭2 h,加一抗于4℃孵育过夜，TBST洗膜后加入二抗，室温孵育2 h，再次经TBST洗膜后置于暗室进行曝光显影，并用UVP凝胶成像分析系统采图，并用Image J软件分析结果。

2 结果

2.1实时荧光定量PCR结果 对实验所得数据进行分析，肺癌患者所致恶性胸腔积液中Beclin-1 mRNA表达水平低于对照组(P<0.05)；LC3 mRNA表达水平低于对照组(P<0.05)；mTOR mRNA在恶性胸腔积液中的表达量高于对照组(P<0.05)。见图1。

图1 胸腔积液中自噬相关蛋白mRNA表达量

2.2Western blot结果 对实验所得数据进行分析，肺癌患者所致恶性胸腔积液中Beclin-1和LC3蛋白表达水平均低于对照组(P<0.05)；mTOR 蛋白在恶性胸腔积液中的表达量高于对照组(P<0.05)。见图2。

图2 胸腔积液中自噬相关蛋白表达含量

3 讨论

肺癌是最常见的恶性肿瘤疾病[9]，严重影响着人类健康。在临床中恶性胸腔积液通常是癌症的最初表现，同时也是非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)患者的常见并发症之一。当有大量胸腔积液产生时，会使患者出现明显的气短、胸闷、心悸、呼吸困难，甚至端坐呼吸并发绀的症状，严重地影响其正常生活。有研究报道指出发生MPE的患者死亡率常常高于那些发生肿瘤转移而无MPE表现的患者[10]。因此，对肺癌发生机制进行深入探讨是临床诊疗的重要环节，而准确快速地对胸腔积液性质进行鉴别也是临床实验室的迫切需要。

近年来，研究发现肿瘤的发生不仅与细胞的异常增殖和凋亡有关，还与细胞内的自噬现象存在某种联系[11]。现已证明自噬可以对肿瘤细胞起到抑制作用[12]，且自噬过程中任何一个环节出现问题都可能会导致肿瘤的发生发展。自噬是真核细胞内“自己吃自己”的一种现象，它通过清除损伤的细胞器和降解长寿命蛋白质，对细胞进行良好的质量控制，进而维持基因组的稳定性，防止体内发生慢性组织、细胞损伤和炎症反应，并且能够抑制致癌基因p62的积累，从而防止肿瘤的发生、侵袭、扩散和转移，起到抑制肿瘤细胞生长的作用[13]。

本次实验通过对自噬相关蛋白在胸腔积液中的表达研究发现Beclin1、LC3和mTOR在良、恶性胸腔积液中均有表达。在基因层面上，Beclin1 mRNA和LC3 mRNA在实验组中的表达量明显低于对照组，而mTOR mRNA表达量则较对照组升高，且差异均具有统计学意义，这与自噬在肿瘤代谢中的表达相一致[14-15]。基因水平呈现上述表达变化的原因如下：Beclin1 是一种肿瘤抑制基因，在小鼠实验中发现Beclin1的异源敲除会使小鼠易患癌症，而且在异种移植癌症模型的研究中也发现自噬基因Beclin1的缺失会使肿瘤细胞呈现加速生长的状态，但是转染外源性的Beclin1后会使肿瘤细胞的生长受到抑制[16]。在肿瘤细胞中AMPK表达量明显降低，致使ULK1复合物激活减少，并使其下游的Beclin1含量大大降低。而Beclin1能够通过泛素样系统的脂质化作用将LC3B-1型转化为LC3B-II型。Beclin1和LC3的表达含量降低表明自噬体形成减少。同时，AMPK磷酸化减少会使其对mTOR的负性调控作用减弱，从而使mTOR在恶性胸腔积液组中大量表达。在蛋白表达层面上，实验组中的Beclin1和LC3蛋白表达含量较对照组降低。这可能与其发生基因突变有关。有研究报道卵巢癌、乳腺癌中Beclin1基因组突变的频率较高。而LC3基因的突变也参与了白血病、胶质母细胞瘤等的发生[16]。上述这些发现均提示自噬缺陷与肿瘤发生之间的关系，但其具体机制还需进一步验证。实验组中mTOR的蛋白表达量较对照组升高，且差异具有统计学意义。这可能与恶性胸腔积液中AMPK的活化减少有关，使其不能起到抑制mTOR活性的作用。

本研究表明，自噬相关蛋白Beclin1、LC3、mTOR在良性和肺癌患者恶性胸腔积液中均有表达，且表达具有统计学差异。我们初步研究并探讨自噬的调控机制和三种自噬相关蛋白在良恶性胸腔积液中的表达情况，希望能为临床实验室提供一种新型的、简便的、更加准确地定性胸腔积液的辅助诊断方法，并为临床治疗和预后判断提供新的线索，以期为肺癌的早期预防、诊断及靶向治疗提供新的方向和理论依据。