HPLC法测定核桃仁不同品种、不同部位中的鞣花酸含量

杨婷婷，顾丰颖，刘昊，邵之晓，张巧真，王锋

（中国农业科学院农产品加工研究所农业农村部农产品加工重点实验室，北京 100193）

近年来，越来越多的研究证明核桃可以改善多种慢性疾病[1]，如动脉硬化、糖尿病、心血管疾病等[2-4]，并对炎症、癌症、记忆力等产生有益的影响[5]，这些功能活性主要与其不饱和脂肪酸和生物活性物质，如酚类、生育酚、甾醇等有关[6-7]。在坚果中，核桃酚酸组成最多样[8]，总酚含量显著高于我们饮食中常见的其它坚果（杏仁、夏威夷果、花生等）[9-10]。核桃的总酚含量在1 558mg/100 g～1 625 mg/100 g[11]，其中主要是鞣花单宁（ellagic tannins，ETs）[12]，属于可水解单宁[13-15]，在酸性条件下水解释放鞣花酸，部分鞣花酸以游离态的形式存在。ETs和鞣花酸由于具有较高的抗氧化活性[16]，摄入ETs含量较高的食物，对预防心血管疾病和癌症等有益[17-18]，因此准确定量鞣花酸对评价核桃营养品质具有重要意义。目前常使用的方法有紫外分光光度法[19]、高效毛细管电泳法[20]等，由于核桃多酚成分复杂且同分异构体较多，常规方法对鞣花酸定量不准确[12]。本试验使用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法对比分析核桃仁不同品种、不同部位的鞣花酸含量，期望为核桃种植、加工、消费提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

温185、新2核桃：新疆阿克苏木本粮油林场；古县绵核桃、辽河1号核桃：古县古树有限公司；所有样品均带壳真空包装于4℃冷藏保存6个月测定。

1.2 主要仪器和试剂

1.2.1 主要仪器

1260 II HPLC系统、紫外检测器：美国安捷伦公司；Synergi Hydro-RP C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，4 μm）：广州菲罗门科学仪器有限公司；CK2000球磨仪：北京托摩根生物科技有限公司；HT 16MM台式高速离心机：湖南赫西仪器装备有限公司；2X-2真空泵：南京真空泵厂；ME104E电子天平：瑞士Mettler Toledo公司；KQ-600DE型高频率数控超声波清洗器：昆山市超声波仪器有限公司；WT-12A型氮吹仪：杭州米欧仪器有限公司；MS-70型水分快速测定仪：广州艾安得仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；DHG-9203A型烘箱：上海精宏实验设备有限公司；FE100型钢磨：天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2.2 主要试剂

鞣花酸（≥98%）：上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯）：美国Fisher Scientific公司；甲酸（色谱纯）：北京阿拉丁生物科技有限公司；丙酮（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；本试验所有用水均为超纯水。

1.3 方法

1.3.1 样品溶液制备

种皮及脱皮仁制备：参考周晔[21]的方法加以改进，将手工脱壳后的核桃仁使用双层纱布扎口后吊入液氮中，30 s后取出，在空气中放置至核桃仁表面白霜消失，温度恢复至室温（25℃左右）人工剥掉种皮，收集种皮和脱皮仁。

脱脂样品制备：将所有样品使用钢磨打碎，每次10 s，重复2次，中间翻拌一次。称取一定量粉碎后样品参考毛晓英[22]的方法得到脱脂粉，为了样品更加均匀使用球磨仪研磨30 s后取出，备用。

样品溶液制备：准确称取0.100 g脱脂核桃粉于15 mL离心管中，加入3 mL体积分数为60%的丙酮溶液，轻轻振荡使其混合均匀，240 W超声5 min后，4 000 r/min离心5 min，缓慢倒出上清液，该提取步骤重复2次，合并上清液并氮吹至溶液体积小于1 mL，超纯水定容至10 mL棕色容量瓶中，即为鞣花酸提取液，每种样品设置3个平行。

1.3.2 标准溶液制备

精确称取5.0 mg鞣花酸标准品于50 mL棕色容量瓶中，鞣花酸标准溶液使用色谱级甲醇定容，得到100 μg/mL鞣花酸标准储备液。

1.3.3 鞣花酸标准曲线绘制

将鞣花酸标准储备液配制成 5、10、20、30、40μg/mL的标准工作液，使用HPLC测定。以鞣花酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制鞣花酸标准曲线和回归方程。

1.3.4 色谱条件

色谱柱：Synergi Hydro-RP C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，4 μm）；1260 II HPLC 系统配备四元泵，自动进样器；紫外检测波长254 nm；流动相A：0.1%甲酸水溶液；B：0.1%甲酸乙腈；进样量 10 μL；流速：1 mL/min；柱温：35℃。流动相梯度洗脱条件见表1。

表1 流动相梯度洗脱条件Table 1 The elution gradient of the mobile phase of HPLC

1.3.5 鞣花酸含量测定

所有样品提取液经0.22 μm微孔滤膜过滤，用高效液相色谱分析。各样品根据标准曲线计算鞣花酸含量。

1.4 数据统计与分析

运用SPSS 19.0进行显著差异分析（Duncan），显著差异水平取p＜0.05，Excel绘图。数据为3次测定的平均值。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

综合考虑分离度、峰型，确定最佳色谱条件为进样量 10 μL，流速1 mL/min，柱温 35℃，检测波长 254 nm，该色谱条件下，鞣花酸标准溶液的色谱图见图1。

图1 鞣花酸标准品色谱图Fig.1 Chromatogram of ellagic acid standard

2.2 标准曲线

将鞣花酸的系列标准溶液按照1.3.4的方法测定，以标准溶液浓度为横坐标（C），以峰面积为纵坐标（S），绘制标准曲线，得到线性回归方程为S=41.006C-207.83，R2=0.995 7，线性范围 5 μg/mL～40 μg/mL。

2.3 精密度

使用20 μg/mL鞣花酸标准溶液连续进样6次，通过标准曲线得到鞣花酸的含量，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果见表2。

表2 鞣花酸精密度试验结果（n=6）Table 2 Results of ellagic precision detection（n=6）

由表2可知，鞣花酸含量的RSD为1.14%，小于5%，可见此方法精密度良好，满足分析要求。

2.4 重复性

分别准确称量核桃仁脱脂粉5份，按照多酚提取方法制得鞣花酸提取液，分别进样计算鞣花酸含量，结果见表3。

表3 重复性试验结果（n=6）Table 3 Results of repeatability test（n=6）

从表3可以看出，核桃整仁鞣花酸含量RSD小于5%，表明该测定方法重复性良好。

2.5 加标回收率

鞣花酸的回收率试验结果见表4。

表4 回收率试验结果（n=3）Table 4 Results of recovery tests（n=3）

由表4可知，回收率在94.15%～105.97%，RSD＜5%，表示该方法准确可靠，可以用于鞣花酸的检测。

2.6 样品测定

2.6.1 核桃仁鞣花酸含量

使用1.3.4的色谱条件测定4种核桃品种核桃仁中鞣花酸含量，色谱图及鞣花酸含量见图2、图3。

图2 温185核桃仁鞣花酸样品色谱图Fig.2 Chromatograms of ellagic acid samples from walnuts at Wen 185

图3 不同品种核桃仁中鞣花酸含量Fig.3 Content of ellagic acid in different varieties of walnut kernel

由图2可以看出，在本试验的HPLC洗脱梯度条件下，鞣花酸对照品色谱峰出峰完全且峰形规范，样品鞣花酸色谱峰分离度良好，基线平稳，无其他杂峰干扰，满足了定性和定量的要求。

由图3可知，山西古县辽河1号、古县绵核桃仁鞣花酸含量是（99.26±1.06）、（90.53±4.31）mg/100 g，新疆地区温185、新2核桃整仁鞣花酸含量分别是（51.39±1.72）、（76.46±7.55）mg/100 g。辽河 1号核桃仁鞣花酸含量分别是新2和温185核桃仁鞣花酸含量的1.30、1.93倍，与新疆主栽品种相比，辽河1号核桃仁在鞣花酸含量上具有明显优势。

2.6.2 核桃仁、种皮、脱皮仁中鞣花酸含量

使用1.3.4的方法测定我国主栽品种之一新疆温185核桃仁、种皮和脱皮仁中鞣花酸含量，结果如表5所示。

表5 新疆温185核桃仁、种皮、脱皮仁中鞣花酸含量Table 5 The contents of ellagic acid in kernel，pellicle and kernel without pellicle

从表5可以看出，核桃种皮中鞣花酸含量最高，其含量高达到（585.93±31.50）mg/100 g，是核桃仁中鞣花酸的11.4倍，脱皮仁中鞣花酸的28.6倍。从质量上来看，种皮质量约占核桃仁的5%～6%，核桃仁中约60%鞣花酸来源于种皮，40%来源于脱皮仁。

3 讨论

3.1 鞣花酸HPLC定量方法

目前关于核桃鞣花酸的定量相关研究中，使用HPLC法较多[23]，但由于核桃多酚成分复杂，色谱峰分离程度不高，定量不准确等情况，本试验依次考察色谱柱、流动相、洗脱梯度对色谱峰的影响，最终使得在本试验HPLC条件下，核桃多酚中的鞣花酸单体得到良好的分离效果，色谱峰基线平稳（图2），实现了快速、准确的定量。

3.2 不同品种、不同部位对核桃鞣花酸含量的影响

本试验测定样品结果与Li等[24]的核桃仁游离型鞣花酸含量为25 mg/100 g～32 mg/100 g结果存在一定差异，可能与使用的核桃品种、提取溶剂和测定条件有关。与新疆主栽品种相比，古县核桃外壳硬度大，缝合线紧密，核桃仁中多酚类物质在采收后得到较好的保留，而新疆主栽品种温185和新2核桃壳薄、缝合线不紧密，核桃仁多酚类物质容易被水分、温度、光照等因素影响，造成多酚氧化、降解[25]，也有研究表明这主要与核桃品种、核桃栽培区域、采收及贮藏条件有直接关系[26]。与新疆主栽品种相比，山西古县地区地方性品种在鞣花酸含量上具有明显优势，可在核桃营养产品开发上引起更多关注，核桃不同部位之间鞣花酸的含量差异表明，核桃仁整仁食用营养价值更高。

鞣花酸作为核桃多酚中最重要的一种多酚类物质，其在核桃中的多种存在形态随着核桃的生长、加工以及贮藏发生着变化，核桃中鞣花酸含量的准确定量，对其形态转化及自身稳定性的研究有着重大的意义。

4 结论

本研究建立了HPLC法测定核桃仁中鞣花酸含量，并对山西古县产区核桃及新疆两个主栽核桃品种的核桃仁中鞣花酸含量以及鞣花酸在核桃仁不同部位的分布进行了测定，其中辽河1号核桃仁鞣花酸含量达到（99.26±1.06）mg/100g，分别是新2和新疆温185品种鞣花酸含量的1.30、1.93倍，与新疆主栽品种相比，古县核桃在鞣花酸含量上具有明显优势；核桃种皮中鞣花酸含量最高，达（585.93±31.50）mg/100 g，脱皮仁中鞣花酸含量较少，仅为（20.52±0.38）mg/100 g，远低于种皮中鞣花酸含量。本研究通过对色谱条件的考察，建立HPLC法测定核桃仁中鞣花酸的含量，灵敏度高，适用范围广泛，将为核桃仁中鞣花酸后续研究提供参考。