槲皮素对病毒性脑炎幼鼠症状的缓解及对TLR9通路的调节作用研究

2022-02-28 07:34闫宇娇王德莉石对先
吉林中医药 2022年2期
关键词:幼鼠槲皮素激动剂

闫宇娇,王德莉,石对先

(河南中医药大学第五临床医学院/郑州人民医院,郑州 450000)

病毒性脑炎(viral encephalitis,VE)是一种常见于儿科的感染性中枢神经系统急症[1]。该病因病毒种类以及侵犯部位的不同,临床表现呈多样化,主要为头痛、呕吐、抽搐、发热、运动功能障碍、意识模糊等[2]。目前临床对病毒性脑炎尚无有效的治疗方法,通常采取控制发热、炎症,降低免疫反应损伤,防止呼吸衰竭等措施,但效果并不理想,且其临床特征不明显,易被误诊延误治疗,以致预后不佳,致残率、病死率居高不下[3]。因此,探寻疗效更加确切的病毒性脑炎治疗方式,对于改善病毒性脑炎预后意义重大。槲皮素是慢性支气管炎常用药物,也可用于冠心病、高血压的辅助治疗,具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基、免疫抑制、抗病毒等功效[4]。本研究通过建立病毒性脑炎幼鼠模型,研究槲皮素对病毒性脑炎的治疗作用,并探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 SPF级雄性BALB/c幼鼠50只,3周龄,体质量(9.45±0.45)g,购自上海茂生衍生物科技有限公司,生产许可SCXK(沪)2017-0004。槲皮素(纯度≥98%,上海源叶生物科技有限公司),柯萨奇病毒B3悬液(武汉博威德生物技术有限公司),Toll样受体(toll-like receptor,TLR)9/髓样分化因子88(myeloid differentiation factor88,MyD88)信号通路激动剂CpG寡脱氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotide,CpG ODN)(上海易汇生物科技有限公司),肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)、钙结合蛋白(S100 calciumbinding protein B,S-100B)酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(上海雅吉生物科技有限公司),二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司),兔抗小鼠TLR9、MyD88、核转录因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)、p-NF-κB蛋白一抗(美国R&D公司)。CX23光学显微镜(日本奥林巴斯株式会社),iMark酶标仪、Gel Doc XR凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司),TY-80电泳仪(南京普阳科学仪器研究所)。

1.2 建立病毒性脑炎模型[5]从50只BALB/c幼鼠中随机抽取10只作为对照组,其余建立病毒性脑炎模型。乙醚麻醉后,在右侧眼角与耳根连线中点进针2~3 mm,颅内注射30 μL 100 TCID50 10-3病毒浓度,对照组同位置注射同体积生理盐水。将建模幼鼠随机分为模型组(13只)、槲皮素组(13只)、槲皮素加激动剂组(14只)。实验结束后观察脑组织病理变化,以出现明显病理改变为建模成功。剔除建模失败幼鼠数据及实验过程中死亡幼鼠数据,模型组、槲皮素组建模失败2只,死亡1只,槲皮素加激动剂组建模失败2只,死亡2只,最终各组均纳入10只。

1.3 干预[6-7]建模完成后,槲皮素组灌胃槲皮素生理盐水溶液1 mL(含药量100 mg/kg),腹腔注射生理盐水0.6 μg/g,槲皮素加激动剂组灌胃槲皮素生理盐水溶液1 mL(含药量100 mg/kg)后腹腔注射CpG ODN 0.6 μg/g,对照组、模型组灌胃等体积生理盐水,腹腔注射生理盐水0.6 μg/g。每天1次,持续7 d。

1.4 组织取材 末次干预后,各组幼鼠禁食禁水6 h,腹腔注射戊巴比妥钠深度麻醉,抽取腹主动脉血注入离心管内,3 000 r/min离心15 min,取其上清,置于液氮中保存,后脱颈处死幼鼠,摘取脑组织,分成3份,1份用4%多聚甲醛固定24 h,梯度乙醇脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋,经病理切片机制作为厚度4 μm连续切片用于HE染色;两份置于液氮中保存用于ELISA实验及蛋白检测。

1.5 检测脑组织炎症指标TNF-α、IL-1β水平 取液氮保存的脑组织,剪碎后加入PBS 1 mL,注入预冷玻璃匀浆器中,充分研磨,4 ℃ 10 000 r/min离心15 min(离心半径8 cm),取其上清,采用ELISA法检测脑组织中TNF-α、IL-1β水平,按照ELISA试剂盒说明书要求设计实验步骤,经酶标仪测定波长570 nm位置吸光度值,通过标准曲线计算TNF-α、IL-1β浓度。

1.6 检测血清神经功能指标IFN-γ、S-100B水平 取液氮保存的主动脉血清,采用ELISA法检测血清中IFN-γ、S-100B水平,按照ELISA试剂盒说明书要求设计实验步骤,经酶标仪测定波长570 nm位置吸光度值,通过标准曲线计算IFN-γ、S-100B浓度。

1.7 HE染色观察脑组织病理学改变 取脑组织切片常规脱蜡,自来水冲洗,加入苏木精液染色,自来水冲洗,盐酸乙醇冲洗3 s,自来水冲洗,加入Scott蓝化液反蓝,自来水冲洗,伊红液染色,梯度乙醇脱水、透明,滴入中性树胶封片,光镜下观察脑组织病理学变化,并拍照记录。

1.8 Western blot法检测脑组织TLR9、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达 取液氮保存的脑组织研磨器研磨,加入PBS洗涤匀浆,置于离心管中,注入RIPA裂解液裂解,8 500 r/min离心15 min(离心半径8 cm),经BCA试剂盒定量蛋白。取40 μg样品与上样缓冲液1:5体积比混合,沸水浴5 min,离心取其上清,恒压80 V行上样电泳分离,改110 V湿法转膜,5%脱脂牛奶常温封闭2 h,TBST洗膜,加入兔抗小鼠TLR9、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65一抗(1:500),4 ℃摇床孵育2 h,TBST洗膜,加入山羊抗兔IgG二抗(1:2 000),常温孵育2 h,TBST洗膜,加入ECL发光液显色,暗室曝光,经凝胶成像系统扫描拍照,分析灰度值,以TLR9、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白灰度值/GAPDH灰度值表示TLR9、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白相对表达量。计算p-NF-κB p65/NF-κB p65。

1.9 统计学处理 采用SPSS 19.0对数据进行分析与处理,采用均数±标准差(x±s)描述计量资料,采用单因素方差分析比较多样本计量资料,以LSD-t检验比较两两样本。

2 结果

2.1 行为学观察 对照组幼鼠未见行为学异常;建模后幼鼠接种病毒后陆续出现活动量减少、蜷缩、毛发松散、食欲减轻等表现,3 d后出现肢体麻痹、抽搐、耳廓尾部坏死等表现,4只幼鼠死亡,槲皮素组、槲皮素加激动剂组干预后上述症状均有所改善。

2.2 炎症指标水平 与对照组比较,模型组脑组织TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.05);与模型组比较,槲皮素组脑组织TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.05);与槲皮素组比较,槲皮素加激动剂组脑组织TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组幼鼠脑组织炎症指标水平比较(,n =10)ng/mL

表1 各组幼鼠脑组织炎症指标水平比较(,n =10)ng/mL

注:与对照组比较,# P<0.05;与模型组比较,△P<0.05;与槲皮素组比较,▲P<0.05

2.3 神经功能指标IFN-γ、S-100B水平 与对照组比较,模型组血清IFN-γ、S-100B水平升高(P<0.05);与模型组比较,槲皮素组血清IFN-γ、S-100B水平降低(P<0.05);与槲皮素组比较,槲皮素加激动剂组血清IFN-γ、S-100B水平升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组幼鼠脑组织神经功能指标水平比较(,n =10)

表2 各组幼鼠脑组织神经功能指标水平比较(,n =10)

注:与对照组比较,# P<0.05;与模型组比较,△P<0.05;与槲皮素组比较,▲P<0.05

2.4 HE染色观察脑组织病理学改变 HE染色结果显示,对照组幼鼠脑组织神经元结构正常;模型组幼鼠脑组织明显水肿,大量神经细胞坏死,神经元树突消失、细胞核染色重,炎性细胞大量浸润;槲皮素组、槲皮素加激动剂组幼鼠脑组织水肿程度减轻,神经元少量变性,炎性细胞少量浸润,槲皮素组病理改善程度更为明显。见图1。

图1 HE染色观察各组脑组织病理变化(×400,标尺25 μm)

2.5 脑组织TLR9、MyD88蛋白表达量、p-NF-κB p65/NF-κB p65 与对照组比较,模型组脑组织TLR9、MyD88蛋白表达量、p-NF-κB p65/NF-κB p65升高(P<0.05);与模型组比较,槲皮素组脑组织TLR9、MyD88蛋白表达量、p-NF-κB p65/NF-κB p65降低(P<0.05);与槲皮素组比较,槲皮素加激动剂组脑组织TLR9、MyD88蛋白表达量、p-NF-κB p65/NF-κB p65升高(P<0.05)。见图2,表3。

图2 Western blot法检测脑组织TLR9、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达

表3 各组脑组织TLR9、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达(,n =10)

表3 各组脑组织TLR9、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达(,n =10)

注:与对照组比较,# P<0.05;与模型组比较,△P<0.05;与槲皮素组比较,▲P<0.05

3 讨论

病毒性脑炎是由于脑实质被各种病毒侵犯而引发的急性炎症疾病,其病情与患者的免疫状态关系密切,智力降低、瘫痪、癫痫等预后不良后遗症频发[8]。疱疹病毒、小肠病毒、日本脑炎病毒、巨细胞病毒均是病毒性脑炎的常见病原体,我国流行病调查研究显示,小肠病毒是病毒性脑炎最常见的病因[9]。目前病毒性脑炎发病机制尚不明确,通常认为与灰质炎症反应及免疫介导损伤有关[10]。尽管西药可在一定程度上保护病毒性脑炎脑损伤,但由于药物自身疗效的局限性及不良反应,临床应用受到一定限制。随着对祖国医学研究的逐步深入,相对安全的中药及其单体成分逐渐应用于病毒性脑炎治疗中。

IFN-γ是辅助T1样细胞、自然杀伤细胞活化后产生的单糖蛋白,可间接活化巨噬细胞、中性粒细胞,增强其吞噬能力及抗病毒能力,是机体重要免疫调控因子,常用来作为神经功能损伤标记物[11]。S-100B是脑组织胶质细胞分泌的高度保守的钙结合蛋白,在机体中枢神经系统中广泛分布,其会在脑组织损伤时溢出,进入脑脊液及血液中,是判断脑损伤程度的特异性指标之一[12]。槲皮素是提取自壳斗科、小檗科、金丝桃科植物皮叶的黄酮醇类化合物,在植物界广泛分布,是一种天然抗氧化剂,国外常被用于治疗前列腺癌[13]。有研究表明[14],槲皮素通过抑制小胶质细胞衍生的氧化应激反应和炎症反应,有效减轻小鼠脑梗塞体积及认知、运动功能缺陷,提示其对脑损伤的治疗作用。本研究结果显示,与模型组比较,槲皮素组脑组织TNF-α、IL-1β水平、血清IFN-γ、S-100B水平降低,HE染色结果显示,与模型组比较,槲皮素组脑组织水肿程度减轻,神经元变性、炎性细胞浸润减少,提示槲皮素可降低脑组织炎症反应,减轻神经功能损伤及脑组织病理学变化。

TLR9/MyD88信号通路是机体经典炎症反应通路。TLR9是模式识别受体蛋白,广泛分布于多种细胞膜及细胞内,参与介导机体先天及特异性免疫[15]。MyD88是其下游转接蛋白,TLR9与相关损伤因子配体结合后,激活MyD88蛋白,通过信号传导刺激NF-κB,其磷酸化后转移至细胞核,诱导巨噬细胞、单核细胞合成并释放TNF-α、IL-1β等炎症因子,促进炎症反应发生[16]。Zhou等[17]研究认为,抑制TLR9信号通路可下调脑组织炎症因子IL-1β、TNF-α水平,对小鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用。本研究结果显示,与对照组比较,模型组脑组织TLR9、MyD88蛋白表达量、p-NF-κB p65/NF-κB p65升高,经槲皮素干预后均降低,且在槲皮素基础上增用TLR9/MyD88信号通路激动剂CpG ODN可减弱槲皮素对病毒性脑炎的治疗作用,提示TLR9/MyD88信号通路在病毒性脑炎中异常激活,槲皮素可能通过抑制该通路对病毒性脑炎幼鼠产生治疗作用。

综上所述,槲皮素可缓解病毒性脑炎幼鼠症状,减轻炎症反应及神经功能损伤,推测其作用机制与抑制TLR9/MyD88信号通路有关。

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