不同腧穴配伍治疗失眠模型大鼠效应机制差异的研究

冯志涛，邱占爽，王之虹

（长春中医药大学，长春 130117）

失眠是指患者入睡困难或多梦易醒导致睡眠质量差、睡眠时间少进而表现出日间疲劳、思睡、厌食的一种主观症状[1]。针刺治疗失眠具有起效快、无不良反应等特点，然而临床中不同的医家治疗原发性失眠（胃气失和型）的腧穴配伍差异性很大，胡幼平教授重视辨证选穴，以中脘、足三里配伍为主；王富春教授重视辨病选穴，以百会、三阴交、神门配伍为主；导师王之虹教授重视辨证结合辨病选穴，以百会、三阴交、神门、足三里、中脘配伍为主；临床中3种腧穴配伍治疗失眠均可起到良好的疗效。为明确3种腧穴配伍之间效应机制的差异及针刺治疗失眠的最佳选穴方法，本实验以PCPA致大鼠失眠模型为研究对象，选取大鼠血清中胃动素（MTL）、胃泌素（GAS）、5-羟色胺（5-HT）、褪黑素（MT）为客观研究指标，以期提供客观的证据支持临床中针刺治疗失眠的选穴依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 50只Wister大鼠，健康，雄性，SPF级，2月龄，体质量（200±20）g，长春中医药大学提供[动物许可证：SCXK（吉）-2020-002]。实验室内温度调控在20～26 ℃、湿度60%～80%、室内光照按照白昼交替、按时摄食、自由摄水，适应7 d后分为空白组（n=10），造模组（n=40），造模结束后将造模组随机分模型组（n=10）、辨证选穴组（n=10）、辨病选穴组（n=10）、辨证结合辨病选穴组（n=10）。

1.2 主要试剂与仪器 试剂：PCPA（美国 Sigma，CAS号：103616-89-3），戊巴比妥钠 上海化学试剂公司提供（F20180816），大鼠MTL 试剂盒（长春市弘扬科技有限公司提供，批号：20201356），大鼠GAS试剂盒（长春市弘扬科技有限公司提供，批号：20201378），大鼠5-HT试剂盒（吉林省博创科技有限公司，批号：20205623），大鼠MT试剂盒（吉林省博创科技有限公司，批号：20203412）。

仪器：一次性无菌针灸针（0.25 mm×25 mm，长春爱康医疗器械有限公司），自动酶标分析仪（赛默飞世尔仪器有限公司），低温高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂），自动平衡离心机（湘仪离心机仪器有限公司）。

1.3 失眠模型 采用国内外公认的腹腔注射PCPA造模法建立失眠大鼠模型[2]，具体操作如下：将0.9%生理盐水中加入碳酸氢钠片调成弱碱性（pH值7.0～8.0）水溶液，将PCPA研磨成细粉按照1 mL/100 mg配制成混悬液备用，临用前用自动平衡离心机震荡摇匀；每日上午8:00－8:30根据大鼠体质量（400 mg/kg）对造模组大鼠进行腹腔注射，空白组给予腹腔注射等剂量的生理盐水，连续注射2 d。

1.4 治疗方法 治疗组包括辨证选穴组：中脘、足三里；辨病选穴组：神门、三阴交、百会；辨病结合辨证选穴组：足三里、中脘、神门、百会、三阴交，取穴具体位置及针刺操作规范参照《实验针灸学》[3]。造模完成后第2天早上8:00－9:00对治疗组失眠大鼠抓摸后针刺，留针1 min，只捻转不提插，平补平泻手法，连续治疗7 d；模型组和空白组不做任何治疗，给予相同的抓摸时间，共7 d。

1.5 观察指标及检测方法 翻正实验：造模完成后12 h及末次治疗后根据大鼠体质量腹腔注射戊巴比妥钠（按照50 μg/mL配比，溶于0.9%生理盐水中，给药剂量35 mg/kg），检测睡眠潜伏期及睡眠时间，将大鼠仰卧位放置于平板上，若大鼠在60 s内不翻动，可视为翻正反射消失，给药到翻正反射消失的时间为睡眠潜伏期；继续记录时间直至大鼠自动翻动身体且在60 s内不再将身体翻转过去的时间为睡眠时间。

ELISA法检测大鼠血清中MTL、GAS、5-HT和MT的含量，末次治疗结束后，腹腔注射10%的水合氯醛（3 mL/kg），大鼠麻醉后腹主动脉取血4 mL，分别置于EP管中，做好组别标记后，放入冰块中冷藏，随即将EP管放入离心机中，3 000 r/min，离心10 min，取出EP管，用移液枪吸出离心后的上层血清100 μL，放入-20 ℃冰箱保存备用。分别按试剂盒说明书检测血清中MTL、GAS、5-HT和MT的含量。向预先包被了MTL、GAS、5-HT和MT单克隆抗体的酶标孔中加入MTL、GAS、5-HT和MT温育；温育后，加入生物素标记的抗MTL、GAS、5-HT和MT抗体，再与链霉亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，再经过温育和反复洗涤，去除未结合的酶，加入显色液，避光温育，最后加入终止液，用多功能微孔板测读仪测定MTL、GAS、5-HT和MT的吸光度（A）值。将A值和标准品浓度建立标准方程，利用样本A值结合标准方程求得MTL、GAS、5-HT和MT的浓度[4]。

1.6 统计学处理 数据采用SPSS 21.0统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，2组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 不同腧穴配伍组对失眠模型大鼠睡眠时间、睡眠潜伏期结果的影响 第1次腹腔注射PCPA造模36 h后，对大鼠进行翻正实验，与空白组相比，造模组睡眠潜伏期明显延长（P＜0.01），睡眠时间显著缩短（P＜0.01），见图1。造模组大鼠烦躁、多动、昼夜节律紊乱，说明造模成功，将造模组（n=40）大鼠随机分为模型组（n=10）、辨证选穴组（n=10）、辨病选穴组（n=10）、辨证结合辨病选穴组（n=10）。针刺治疗7 d后，辨证、辨病、辨证结合辨病选穴组与模型组相比，睡眠潜伏期明显缩短（P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01），睡眠时间明显延长（P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01）；其中与辨证、辨病选穴组相比，辨证结合辨病选穴组的睡眠潜伏期缩短（P＜0.05），睡眠时间延长（P＜0.05），见图2。

图1 空白组与造模组大鼠睡眠潜伏期(SL)和睡眠时间（ST）比较

图2 各组大鼠睡眠潜伏期（SL）和睡眠时间（ST）比较

2.2 不同腧穴配伍组对失眠模型大鼠血清GAS、MTL、5-HT和MT含量的影响 与空白组相比，模型组血清中GAS、MTL、5-HT和MT的含量明显降低（P＜0.01）；与模型组相比，辨证、辨病、辨证结合辨病选穴组血清中GAS、MTL含量明显增加（P＜0.01、P＜0.05、P＜0.05），其中与辨病、辨证结合辨病选穴组相比，辨证选穴组血清中MTL、GAS含量增加明显（P＜0.05），见图3；与模型组相比，辨证、辨病、辨证结合辨病选穴组血清中5-HT、MT明显增加（P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01），与辨证、辨病选穴组相比，辨病结合辨证选穴组血清中5-HT、MT含量增加明显（P＜0.05），见图4。

图3 各组大鼠胃泌素（GAS）和胃动素（MTL）比较

图4 各组大鼠5-羟色胺（5-HT）和褪黑素（MT）比较

3 讨论

腧穴配伍是在选穴原则的基础上根据病症选取有效的穴位，是针灸处方中重要组成部分，为针灸治疗疾病提供方案的选穴方法[5]。临床中不同医家治疗失眠的腧穴配伍差异性很大，胡幼平教授治疗失眠时重视调理脾胃，调畅气机，以“胃不和则卧不安”为选穴依据，重视辨证选穴，临床中治疗原发性失眠（胃气失和型）处方中多以中脘、足三里配伍为主，并提出“和胃安神”针法治疗失眠[6]，中脘、足三里为合募配穴，中脘能使胃容性扩张，足三里促进胃肠蠕动[7]，二穴配伍和胃、降气、安神，胃和则卧安；王富春治疗失眠重视辨病选穴，临床中治疗原发性失眠（胃气失和型）处方以百会、三阴交、神门配伍为主，并提出“镇静安神”针法治疗失眠[8]，百会位于巅顶，深系脑髓、调节一身阴阳，神门、三阴交宁心和胃，三穴配伍可和胃降气、宁心安神，使阳气趋缓，入阴则寐[9]；王之虹重视辨证结合辨病选穴，临床中治疗原发性失眠（胃气失和型）处方以百会、三阴交、神门、足三里、中脘配伍为主；王之虹提出主症选主穴，辨证选配穴，增效协同，运用同功穴的腧穴配伍理论，针对原发性失眠的主症选用百会、神门、三阴交为主穴，具有镇静安神之功，针对胃气失和证型，配伍中脘、足三里，具有和胃安神之效，以期协同增效，目前在临床中，导师运用辨病与辨证选穴治疗原发性失眠（胃气失和型）疗效确切；3种腧穴配伍选穴理论依据充分，临床中疗效均得到认可，但3种腧穴配伍效应机制的差异还不清楚。

失眠与胃肠功能障碍关系密切，流行病学证实在失眠患者的伴随症状中脾胃功能紊乱发生率高达69.19%[10]，现代医学认为消化系统与神经系统之间的相互作用是通过脑肠轴双向调节脑肠肽含量而实现[11]。参与调节神经系统和消化系统的脑肠肽有20余种，主要包括胃泌素（GAS）、胃动素（MTL）、5-羟色胺（5-HT）、褪黑素（MT）。GAS具有增强胃动力、延缓胃排空等作用，MTL可通过增强胃动力调节昼夜节律的紊乱[12]，有实验报道正常大鼠睡眠剥夺后血清中GAS、MTL的含量变化明显[13]，由此证明GAS、MTL具有调节睡眠节律紊乱的作用；5-HT在胃肠道和中枢神经系统中分布密集，主要参与调节胃肠蠕动及相关激素分泌的同时又有调节睡眠－觉醒周期的作用[14-15]，研究证明5-HT对调节睡眠－觉醒周期发挥重要作用，可通过调节与睡眠相关物质GAGB、Glu、TNF-α的含量调控睡眠－觉醒周期[16]；MT主要分布于胃肠道和中枢神经系统中，具有调节睡眠－觉醒周期、诱导睡眠的作用[17]，MT具有保护胃黏膜完整性、促进溃疡愈合、升高胃泌素含量等作用。

本实验研究结果证明，腹腔注射PCPA可导致大鼠睡眠潜伏期显著延长、睡眠时间明显缩短、血清中MTL、GAS、5-HT、MT含量显著降低；辨证、辨病、辨证结合辨病选穴均可缩短失眠大鼠睡眠潜伏期、延长睡眠时间、增加血清中MTL、GAS、5-HT、MT含量，其中辨证选穴组血清中MTL、GAS含量增加明显，证明辨证选穴主要通过提高MTL、GAS的含量而改善睡眠；辨病结合辨证选穴组血清中5-HT、MT含量增加明显，证明辨证结合辨病选穴通过提高5-HT、MT的含量而改善睡眠。

综上，3种腧穴配伍选穴法的效应机制是通过提高血清中MTL、GAS、5-HT、MT的含量、延长睡眠时间、缩短睡眠潜伏期而改善失眠大鼠的睡眠质量，对失眠具有调治作用；综合3种腧穴配伍对失眠大鼠睡眠潜伏期、睡眠时间及MTL、GAS、5-HT、MT含量的影响支持辨病结合辨证选穴为针刺治疗失眠的最佳腧穴配伍方法。