1-脱氧野尻霉素的合成工艺研究

王峰峰，方志杰

(南京理工大学化学与化工学院，江苏 南京 210014)

目前，临床用于治疗糖尿病的药物大部分存在着较为严重的不良反应。而α-葡萄糖苷酶抑制剂作为20世纪新兴的一类治疗糖尿病的药物，具有用量少、作用显著等特点，其中1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，DNJ)是国际公认的唯一零伤害的生物制剂，其化学名为(2R,3R,4R,5S)-2-羟甲基哌啶-3,4,5-三醇。目前，全球仅有30家左右的DNJ供应商，其中包含了相当一部分经销商，这些供应商绝大多数来自中国，其中60%～70%的供应商仅能提供试剂级的小样或标准品，能提供大批量DNJ的很少。随着DNJ开发力度的加大，近年来国内外市场对DNJ的需求不断增加，但DNJ的合成研究和产能明显落后，使其推广应用受到限制。因此，对DNJ产业化合成路线的研究受到研究者的广泛重视。

通过对DNJ的结构分析，发现其手性中心在2,3,4,5位，与葡萄糖的结构较为相似，因此以葡萄糖或葡萄糖衍生物合成DNJ不仅可以大大降低DNJ合成难度，而且从原子经济学的角度来说无疑是最合适的方法。基于相关文献[1-13]，作者以商业化的2,3,4,6-O-四苄基-D-吡喃葡萄糖(SM)为起始原料，经羟基氧化、内酯氨解后开环得到(2R,3S,4R,5R)-2,3,4,6-四(苄氧基)-5-羟基己酰胺(D-1)；化合物D-1通过斯文氧化得到粗产物，再通过正庚烷-乙酸乙酯纯化得到(2R,3S,4S)-2,3,4,6-四(苄氧基)-5-氧代六酰胺(D-2)；化合物D-2经氰基硼氢化钠还原胺化后再次关环，然后用甲醇精制得到(3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三(苄氧基)-6((苄氧基)甲基)哌啶-2-酮(D-3)；化合物D-3经硼氢化钠和三氟化硼原位还原得到油状粗产物，然后在乙酸乙酯中酸化成盐得到2,3,4,6-四苄基-1-脱氧野尻霉素盐酸盐(D-4)；化合物D-4经Pd(OH)2/C加氢脱苄基反应，最后在甲醇中析晶得到目标化合物DNJ；并对中间体和目标化合物的结构进行确认。该合成路线共5步反应，如图1所示。

图1 DNJ的合成路线

1 实验

1.1 试剂与仪器

2,3,4,6-O-四苄基-D-吡喃葡萄糖，上海皓鸿生物医药科技有限公司；四氢呋喃(THF)、氨水、二甲基亚砜(DMSO)、醋酐(Ac2O)、无水硫酸钠、乙腈、甲酸、碳酸氢钠、正庚烷、三氟化硼四氢呋喃络合物(BF3·THF)、硼氢化钠、浓盐酸、甲醇等均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；碘，分析纯，江苏艾康生物医药研发有限公司；氰基硼氢化钠，分析纯，上海迈瑞尔化学技术有限公司；20%Pd(OH)2/C，陕西瑞科新材料股份有限公司；乙酸乙酯(EA)、二氯甲烷(DCM)，上海佳足实业有限公司。

SHZ-D(Ⅲ)型循环水式多用真空泵、RE-2000型旋转蒸发器、98-2型磁力搅拌器，上海积坤实验仪器有限公司；JA2003型电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；DFY-5L/25型低温恒温浴、DZF-6050型真空干燥箱，卯氏(上海)实验仪器有限公司；HWCL-3型集热式恒温磁力搅拌浴，郑州长城科工贸有限公司。

1.2 方法

1.2.1 化合物D-1的合成

向21.4 g(39.58 mmol)2,3,4,6-O-四苄基-D-吡喃葡萄糖(SM)中加入43 mL(2 V，V表示以原料计的液料比，mL∶g，下同)THF，搅拌均匀，然后依次加入12.0 g(47.28 mmol，1.2 eq.)碘、118 mL(5.5 V)氨水(25%～28%)，密闭条件下于10～20 ℃保温反应20 h；反应结束后加入4.8 g五水硫代硫酸钠搅拌20 min，反应液于30～35 ℃减压浓缩至馏分明显减少；降温至10～25 ℃，加入100 mL×2二氯甲烷萃取2次，合并二氯甲烷层；用30 mL食盐水(15%)洗涤1次，分液；取二氯甲烷层，减压旋干得到23.2 g淡黄色糖浆物(D-1)，将其溶于60 mL DMSO中，待用。

1.2.2 化合物D-2的合成

室温下将86 mL Ac2O滴加到86 mL DMSO中配制Ac2O/DMSO溶液，降温至0～5 ℃，控温0～10 ℃将化合物D-1的DMSO溶液滴加到Ac2O/DMSO溶液中，维持内温5～10 ℃(最佳6～8 ℃)保温反应20 h；控温10～15 ℃向反应液中滴加540 mL水，搅拌15 min，依次用200 mL和100 mL二氯甲烷萃取2次，合并二氯甲烷层；加入300 mL水，缓慢加入50～60 g碳酸钠调节水层pH值为8～9，分液；取二氯甲烷层，加入100 mL水洗涤1次；取二氯甲烷层，减压旋干得到23.6 g黄色糖浆物(D-2粗品)；加入44 mL乙酸乙酯，将D-2粗品搅拌溶解，控温15～25 ℃缓慢滴加176 mL正庚烷搅拌析晶2 h；抽滤，滤饼加入15 mL正庚烷-乙酸乙酯(4∶1，体积比，下同)淋洗；45～50 ℃减压干燥得到14.58 g类白色固体(D-2)，收率66.56%(SM到D-2的两步收率)。m.p.113.6～116.0 ℃；1HNMR(DMSO，400 MHz)，δ：7.53(s, 1H)，7.43(s,1H)，7.40～7.21(m,20H)，4.69～4.51(m,5H)，4.43～4.34(m,5H)，4.31(d,J=4.1 Hz,1H)，4.15(t,J=4.7 Hz,1H)，4.03(d,J=5.1 Hz,1H)。

1.2.3 化合物D-3的合成

取12.0 g 化合物D-2，加入120 mL(10 V)乙腈、24 mL(2 V)甲酸、3.42 g(2.5 eq.)氰基硼氢化钠，升温至80～85 ℃反应3 h；降至室温，过滤，滤饼用12 mL乙腈淋洗，合并滤液于45 ℃减压旋干回收溶剂；向旋干物加入50 mL二氯甲烷、50 mL水，搅拌分液；取二氯甲烷层用30 mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤1次，分液；取二氯甲烷层再用30 mL食盐水洗涤1次，无水硫酸钠干燥，减压旋干得到10.88 g黄色固体(D-3粗品)；加入33 mL(3 V)甲醇升温至回流溶清，降温至0～5 ℃搅拌析晶3 h；抽滤，滤饼用3 mL冰甲醇淋洗，45～50 ℃减压干燥得到7.62 g白色固体(D-3)，收率65.4%。1HNMR(CDCl3，500 MHz)，δ：3.26(t,J=8 Hz,1H)，3.28～3.43(m,1H)，3.43～3.63(m,2H)，3.92(t,J=8.1 Hz,1H)，4.01(d,J=8 Hz,1H)，4.46～4.51(m,3H)，4.73～4.79(m,2H)，4.84～4.88(m,2H)，5.19(d,J=11.2 Hz,1H)，5.95(s,1H)，7.19～7.44(m,20H)；13CNMR(CDCl3，125 MHz)，δ：169.86，137.11，136.92，136.67，136.04，127.62，127.46，127.36，127.22，127.11，127.09，127.00，126.97，126.89，81.35，77.84，76.46，76.40，76.20，76.08，75.95，73.81，73.71，72.40，68.87，52.99。

1.2.4 化合物D-4的合成

取6.5 g 化合物D-3，加入65 mL(10 V)THF溶解；氮气保护下加入1.4 g(3.0 eq.)硼氢化钠，降温至0 ℃左右；控温0～5 ℃滴加6.77 g(4.0 eq.)BF3·THF溶液，回温至15～20 ℃保温反应2 h；缓慢滴加16.3 mL甲醇淬灭反应，滴加6.5 mL浓盐酸，15～20 ℃保温反应16 h；加入32.5 mL水搅拌均匀，滴加约78 mL碳酸钠溶液(20%)调节反应液pH值至9～10，加入65 mL×2乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯层；用65 mL饱和食盐水洗涤1次，再用无水硫酸钠干燥，45～50 ℃减压浓缩至反应液体积约为70～80 mL；缓慢滴加4 mL含氯化氢的乙酸乙酯溶液(4 mol·L-1)，降温至15～20 ℃强力搅拌析晶3 h；过滤，45～50 ℃减压干燥得到5.52 g类白色固体(D-4)，收率81.5%。1HNMR(CDCl3，500 MHz)，δ：2.54(dd,J=8 Hz、12 Hz,1H)，2.77(ddd,J=3 Hz、6 Hz、9 Hz,1H)，3.28(dd,J=4.5 Hz、12 Hz,1H)，3.40(t,J=9 Hz,1H)，3.51～3.61(m,3H)，3.70(dd,J=3 Hz、9 Hz,1H)，4.46～4.54(m,3H)，4.69～4.76(m,2H)，4.87～4.92(m,2H)，5.02(d,1H)，7.23～7.40(m,20H)；13CNMR(CDCl3，125 MHz)，δ：137.98，137.56，137.46，137.04，127.47，127.08，127.01，126.94，126.85，126.75，126.59，86.38，79.69，79.13，76.36，76.10，75.85，74.74，74.26，72.47，71.86，69.29，58.80，47.16。

1.2.5 目标化合物DNJ的合成

取3.0 g 化合物D-4，加入120 mL甲醇搅拌溶解；氮气球置换反应瓶内气体3次，加入2 mL浓盐酸、450 mg 20%Pd(OH)2/C；氮气球再次置换反应瓶内气体3次，然后氢气球置换反应瓶内气体3次，15～25 ℃保温反应约48 h；过滤，滤饼用20 mL纯化水淋洗，将滤液减压浓缩得到1.107 g油状物(DNJ粗品)；加入4 mL甲醇升温至回流保温0.5 h，缓慢降温至0～5 ℃析晶3 h；过滤，滤饼用1 mL甲醇淋洗，50～55 ℃减压干燥得到0.9 g白色固体(DNJ)，收率84.2%。1HNMR(D2O，500 MHz)，δ：3.73(dd,J=11.6 Hz、2.8 Hz, 1H)，3.53(dd,J=11.7 Hz、6.3 Hz,1H)，3.44～3.34(m,1H)，3.22(t,J=9.1 Hz,1H)，3.13(t,J=9.5 Hz,1H)，3.02(dd,J=12.3 Hz、5.1 Hz,1H)，2.50～2.41(m,1H)，2.36(t,J=11.6 Hz,1H)；13CNMR(D2O，125 MHz)，δ：77.35，70.47，69.85，60.33，59.47，47.66。

2 结果与讨论

2.1 化合物D-1的合成工艺优化

实验发现，SM合成D-1的过程副反应很少，产物D-1中几乎没有杂质，因此以原料的转化情况作为评价标准，考察反应物(THF、氨水、碘)投料量对化合物D-1合成的影响，结果见表1。

由表1可知：(1)在THF投料量为4.2 V、氨水投料量为14.5 V时，将碘投料量从1.3 eq.降至1.2 eq.时原料均能反应完全，继续降至1.1 eq.时有少量原料残留，因此，确定最佳碘投料量为1.2 eq.。(2)在THF投料量为4.2 V、碘投料量为1.2 eq.时，将氨水投料量从14.5 V分别降至10.0 V、5.5 V时原料均能反应完全，因此，确定最佳氨水投料量为5.5 V。(3)在氨水投料量为5.5 V、碘投料量为1.2 eq.时，将THF投料量从4.2 V分别降至3 V、2 V时原料均能反应完全，继续降至1 V时有少量原料残留，因此，确定最佳THF投料量为2 V。

表1 反应物投料量对化合物D-1合成的影响

2.2 化合物D-2的合成工艺优化

2.2.1 反应温度的优化

实验发现，由化合物D-1合成化合物D-2的过程对温度较为敏感。在不同温度下，按1.2.2方法合成化合物D-2，考察反应温度对化合物D-2合成的影响，结果见表2。

表2 反应温度对化合物D-2合成的影响

由表2可知，随着反应温度的降低，化合物D-2的收率逐渐升高。当反应温度为15～20 ℃时，化合物D-2的收率为48.0%；当反应温度降至5～10 ℃时，收率提高到65.2%；继续降低反应温度至0 ℃，反应无法正常进行。因此，确定最佳反应温度为5～10 ℃。

2.2.2 纯化工艺优化

由于下步合成化合物D-3时用到的氰基硼氢化钠价格较为昂贵，而且上步产物D-1没有提纯，因此化合物D-2中会残留一些杂质。对化合物D-2进行纯化可以提高D-2的有效含量，这样不仅可以减少下步反应氰基硼氢化钠的用量，而且可以减少副产物的生成，减轻后续纯化的压力。基于此，采用正庚烷-乙酸乙酯对化合物D-2进行纯化，考察正庚烷与乙酸乙酯的体积比(V正庚烷∶V乙酸乙酯)对纯化收率的影响，结果见表3。

表3 正庚烷与乙酸乙酯的体积比对化合物D-2纯化收率的影响

由表3可知，固定乙酸乙酯投料量为2 V，逐渐增加正庚烷投料量，化合物D-2的纯化收率随着V正庚烷∶V乙酸乙酯的增大逐渐升高；当V正庚烷∶V乙酸乙酯为2∶1时，纯化收率为52.3%；当V正庚烷∶V乙酸乙酯为4∶1时，纯化收率提高到66.3%；当V正庚烷∶V乙酸乙酯继续增大至5∶1时，纯化收率升幅不明显，仅为67.1%。因此，确定最佳V正庚烷∶V乙酸乙酯为4∶1。

2.3 化合物D-3的合成工艺优化

2.3.1 反应物投料量的优化

以化合物D-2为原料合成化合物D-3，考察反应物(乙腈、甲酸、氰基硼氢化钠)投料量对化合物D-3合成的影响，结果见表4。

表4 反应物投料量对化合物D-3合成的影响

由表4可知：(1)当乙腈投料量为15 V、氰基硼氢化钠投料量为2.5 eq.时，将甲酸投料量从1.5 V增至2 V时，杂质明显减少，因此，确定最佳甲酸投料量为2 V。(2)当甲酸投料量为2 V、氰基硼氢化钠投料量为2.5 eq.时，将乙腈投料量从15 V减至10 V时，对反应影响不大，因此，确定最佳乙腈投料量为10 V。(3)当乙腈投料量为10 V、甲酸投料量为2 V时，将氰基硼氢化钠投料量从2.5 eq.减至2.0 eq.时，会有少量原料残留，因此，确定最佳氰基硼氢化钠投料量为2.5 eq.。

2.3.2 纯化工艺优化

化合物D-2经过还原反应得到5位R型D-3的同时，会有少量的5位S型异构体杂质产生。基于5位R型D-3为固体、5位S型异构体杂质为油状物，可通过纯化去除异构体杂质。分别采用正庚烷-乙酸乙酯、甲醇对化合物D-3进行纯化，考察纯化溶剂及其用量对化合物D-3纯化收率的影响，结果见表5。

表5 纯化溶剂及其用量对化合物D-3纯化收率的影响

由表5可知，以正庚烷-乙酸乙酯(3∶1)作为纯化溶剂时，用量需要20 V，D-3纯化收率为62.4%；以正庚烷-乙酸乙酯(4∶1)作为纯化溶剂时，用量需要25 V，纯化收率为67.2%；以甲醇作为纯化溶剂时，用量只需要3 V，纯化收率达到71.5%。以甲醇作为纯化溶剂时不仅用量少而且纯化收率高，因此，选择甲醇作为纯化溶剂纯化D-3粗品。

2.4 化合物D-4的合成工艺优化

2.4.1 还原剂的优化

以化合物D-3为原料，通过硼氢化钠和三氟化硼原位还原合成化合物D-4。考察不同还原剂对化合物D-4合成的影响，结果见表6。

表6 不同还原剂对化合物D-4合成的影响

由表6可知，分别以NaBH4+BF3·Et2O、NaBH4+BF3·THF为还原剂时，原料均能反应完全，而且杂质很少；以NaBH4+BF3·ACN为还原剂时，原料虽能反应完全，但杂质较多。由于该步反应溶剂为THF，因此，确定最佳还原剂为NaBH4+BF3·THF。

2.4.2 还原剂投料比的优化

还原剂NaBH4+BF3·THF的反应原理为：NaBH4与BF3反应生成硼烷，硼烷通过原位还原生成内酰胺。在确定化合物D-4合成反应的还原剂为NaBH4+BF3·THF后，对NaBH4与BF3·THF的投料比进行优化，结果见表7。

表7 NaBH4与BF3·THF的投料比对化合物D-4合成的影响

由表7可知，当NaBH4投料量为1.5 eq.、BF3·THF投料量为2.0 eq.时，有较多原料未反应完；提高两者投料量分别至2.25 eq.、3.0 eq.时，有少量原料未反应完；继续提高两者投料量分别至3.0 eq.、4.0 eq.时，原料反应完全。因此，确定最佳NaBH4投料量为3.0 eq.、BF3·THF投料量为4.0 eq.。

2.4.3 硼烷胺络合物解离时间的优化

使用NaBH4+BF3·THF原位还原酰胺的羰基为亚甲基后，并不能直接生成所需的产物，而是生成了硼烷胺络合物，需要加浓盐酸使其完全解离为游离胺，因此需要对解离时间进行优化，结果见表8。

表8 硼烷胺络合物解离时间的优化

由表8可知，随着解离时间的延长，硼烷胺络合物的转化率逐渐升高；当解离时间为2 h时，约15%的硼烷胺络合物转化为游离胺，转化率较低；当解离时间延长至16 h时，硼烷胺络合物转化完全。因此，确定最佳解离时间为16 h。

2.4.4 成盐溶剂的优化

原料的纯度直接影响目标化合物DNJ的纯度。由于化合物D-3原位还原得到的粗产物是油状物，纯化起来较为麻烦，但是它的盐酸盐(化合物D-4)是固体，可以在某些有机溶剂中通过沉淀的方式分离出来，因而可以采用成盐溶剂对油状粗产物进行纯化。通过对常规溶剂进行筛选，发现化合物D-4在二氯甲烷或氯仿中极易溶解，而在醇类溶剂中溶解度较大，因此，选择甲叔醚、丙酮、乙酸乙酯等3种溶剂对油状粗产物进行纯化，考察成盐溶剂对化合物D-4纯化收率的影响，结果见表9。

表9 成盐溶剂对化合物D-4纯化收率的影响

由表9可知，以甲叔醚为成盐溶剂时，化合物D-4的纯化收率最高，为83.2%，但含有约5%的杂质；以丙酮或乙酸乙酯为成盐溶剂时，纯化收率相当，几乎无杂质，纯化效果均较好。考虑到反应后处理的萃取溶剂是乙酸乙酯，实际操作时只需要浓缩出部分乙酸乙酯，即可进行酸化成盐析晶，操作简便。因此，确定乙酸乙酯为成盐溶剂。

2.5 目标化合物DNJ的合成工艺优化

以化合物D-4为原料，通过脱苄基反应合成目标化合物DNJ。考察不同脱苄基试剂组合对DNJ合成的影响，结果见表10。

表10 不同脱苄基试剂组合对目标化合物DNJ合成的影响

由表10可知：(1)在以10%Pd/C为催化剂的情况下，以甲酸为氢源时的DNJ收率约10%，以甲酸铵为氢源时的DNJ收率约15%，以氢气为氢源时的DNJ收率约85%。因此，确定最佳氢源为氢气。(2)将催化剂10%Pd/C替换为20%Pd(OH)2/C，DNJ收率提升到95%以上，而且中间态很少。因此，确定最佳催化剂为20%Pd(OH)2/C。

3 结论

以2,3,4,6-O-四苄基-D-吡喃葡萄糖为起始原料(SM)，经羟基氧化、内酯氨解后得到(2R,3S,4R,5R)-2,3,4,6-四(苄氧基)-5-羟基己酰胺(D-1)，物料比m(SM)∶V(THF)∶V(氨水)为1∶2∶5.5，氧化剂用量n(SM)∶n(碘)为1∶1.2；化合物D-1通过斯文氧化、正庚烷-乙酸乙酯纯化后得到(2R,3S,4S)-2,3,4,6-四(苄氧基)-5-氧代六酰胺(D-2)，反应温度为5～10 ℃，纯化工艺投料比m(D-2粗品)∶V(乙酸乙酯)∶V(正庚烷)为1∶2∶8；化合物D-2经氰基硼氢化钠还原胺化、甲醇纯化后得到(3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三(苄氧基)-6((苄氧基)甲基)哌啶-2-酮(D-3)，物料比m(D-2)∶V(乙腈)∶V(甲酸)为1∶10∶2，还原剂用量n(D-2)∶n(氰基硼氢化钠)为1∶2.5，纯化溶剂甲醇用量m(D-3粗品)∶V(甲醇)为1∶3；化合物D-3在四氢呋喃中经硼氢化钠和三氟化硼原位还原得到油状粗产物，然后在乙酸乙酯中酸化成盐得到2,3,4,6-四苄基-1-脱氧野尻霉素盐酸盐(D-4)，物料比n(D-3)∶n(NaBH4)∶n(BF3·THF)为1∶3.0∶4.0，后处理时硼烷胺络合物最佳解离时间为16 h，成盐溶剂优选乙酸乙酯；最后化合物D-4经Pd(OH)2/C加氢、并在浓盐酸的催化下通过脱苄基反应得到1-脱氧野尻霉素(DNJ)。总计5步反应，其中从SM到D-2的两步收率为66.56%，D-2到D-3的收率为65.4%，D-3到D-4的收率为81.5%，D-4到DNJ的收率为84.2%，总收率在30%左右。该方法操作简便、收率较高，每一步所用到的化学试剂以及实验操作在放大批量时均是可行的，可满足大规模生产的要求。