新型含氟嘌呤喹唑啉酮类PI3Kδ抑制剂的设计合成与活性研究

郑学良，李伟林，梁 青，马 耀

(山西省化工研究所(有限公司)，山西 太原 030021)

多靶点药物已成为最有前景的抗肿瘤药物之一[1]。由PI3K介导的PI3K/AKT信号通路是调控细胞生长、增殖、分化及凋亡的关键信号通路之一，在细胞的生命进程中发挥着至关重要的作用[2]。PI3K/AKT信号通路的失调会引发多种肿瘤的发生，因此，PI3K激酶成为肿瘤治疗的重要靶点之一，目前通路中关键节点的不同类型的抑制剂正处于临床研究阶段，用以治疗人体恶性肿瘤[3-6]。

由于氟原子的电负性强，原子半径与氢原子半径相近，具有形成分子间氢键的特点[7]。将氟原子或含氟基团引入到小分子药物中，对药物结构进行细微的修饰和调整，不但阻断了易代谢的位点，造成药物代谢的途径和速度发生了改变，而且延长了药物在体内的作用时间，提高了生物利用度和选择性[8]。在药物化学中，氟代是最常用、最有效的一种结构修饰方法[9]。

基于PI3Kδ抑制剂IC-87114的结构和氟原子的特点，作者设计并合成3个新型含氟嘌呤喹唑啉酮类PI3Kδ抑制剂，通过1HNMR、LC-MS等对其结构进行表征，并对其抗肿瘤活性进行评价，以期通过含氟位置的变化发现活性更高的化合物结构，为含氟PI3Kδ抑制剂的进一步研究提供思路。合成路线如图1所示。

图1 含氟嘌呤喹唑啉酮类PI3Kδ抑制剂的合成路线

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

小鼠结肠癌细胞CT-26，上海弘顺生物科技有限公司；小鼠(品系：NOD/SCID)，华阜康实验动物技术有限公司。

柱层析硅胶(200～300目)、硅胶薄层板，青岛海洋化工厂；IC-87114原药，上海Sellcek公司；其它试剂均为分析纯。

Bruker AM-600型核磁共振仪；液质联用仪，美国 Waters公司；倒置显微镜，日本 Olympus公司；离心机，美国Thermo公司；电子天平，上海佑科仪器仪表有限公司；R-1001VN型旋转蒸发仪、DLSB-5/20B型低温冷却液循环泵、SHB-B95型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司。

1.2 化合物的合成

1.2.1 中间体2-氨基-6-甲基苯甲酰氯的合成

将2-氨基-6-甲基苯甲酸15 g(99.3 mmol)加入到150 mL甲苯中，加入氯化亚砜30 mL(411 mmol)，升温回流1 h；旋干溶剂，无需纯化，直接用于下一步反应。

1.2.2 中间体Ⅰ的合成

1.2.2.1 中间体Ⅰa的合成

将2-氨基-6-甲基苯甲酰氯2.5 g(14.7 mmol)加入到20 mL无水四氢呋喃中，冰浴降温到0 ℃，氮气保护；将邻甲基苯胺1.5 mL(15 mmol)溶于5 mL无水四氢呋喃中，缓慢滴加到2-氨基-6-甲基苯甲酰氯溶液中；滴加完毕，升温至80 ℃，反应2 h；旋干溶剂，加入碳酸氢钠溶液和乙酸乙酯(EA)萃取2次，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干，经柱层析纯化，流动相为石油醚(PE)-EA(体积比5∶1)，得白色固体中间体Ⅰa 2.3 g。

1.2.2.2 中间体Ⅰb的合成

将2-氨基-6-甲基苯甲酰氯6.0 g(35.3 mmol)加入到50 mL 无水四氢呋喃中，冰浴降温到0 ℃，氮气保护；将4-氟-2-甲基苯胺4.4 g(33.1 mmol)溶于10 mL无水四氢呋喃中，滴加到2-氨基-6-甲基苯甲酰氯溶液中；滴加完毕，升温至80 ℃，反应2 h；旋干溶剂，加入碳酸氢钠溶液和EA萃取2次，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干，经柱层析纯化，流动相为PE-EA(体积比5∶1)，得白色固体中间体Ⅰb 4.0 g。

1.2.2.3 中间体Ⅰc的合成

将2-氨基-6-甲基苯甲酰氯6.0 g(35.3 mmol)加入到50 mL 无水四氢呋喃中，冰浴降温到0 ℃，氮气保护；将5-氟-2-甲基苯胺4.4 g(33.1 mmol)溶于10 mL无水四氢呋喃中，滴加到2-氨基-6-甲基苯甲酰氯溶液中；滴加完毕，升温至80 ℃，反应2 h；旋干溶剂，加入碳酸氢钠溶液和EA萃取2次，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干，经柱层析纯化，流动相为PE-EA(体积比5∶1)，得白色固体中间体Ⅰc 3.5 g[10-11]。

1.2.3 中间体Ⅱ的合成

1.2.3.1 中间体Ⅱa的合成

取中间体Ⅰa 1.37 g(5.7 mmol)加入到5 mL乙酸中，再加入氯乙酰氯1.36 mL(17.1 mmol)，搅拌升温至120 ℃，反应1 h；加入水和EA萃取2次，有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤1次，无水硫酸钠干燥，旋干，经柱层析纯化，流动相为PE-EA(体积比10∶1)，得白色固体中间体Ⅱa 200 mg。

1.2.3.2 中间体Ⅱb的合成

取中间体Ⅰb 3.5 g(13.6 mmol)加入到20 mL乙酸中，再加入氯乙酰氯3.19 mL(40.8 mmol)，搅拌升温至120 ℃，反应1 h；加入水和EA萃取2次，有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤1次，无水硫酸钠干燥，旋干，经柱层析纯化，流动相为PE-EA(体积比10∶1)，得白色固体中间体Ⅱb 900 mg。

1.2.3.3 中间体Ⅱc的合成

取中间体Ⅰc 3.0 g(11.6 mmol)加入到18 mL乙酸中，再加入氯乙酰氯2.73 mL(34.8 mmol)，搅拌升温至120 ℃，反应1 h；加入水和EA萃取2次，有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤1次，无水硫酸钠干燥，旋干，经柱层析纯化，流动相为PE-EA(体积比10∶1)，得白色固体中间体Ⅱc 800 mg。

1.2.4 目标化合物的合成

1.2.4.1 目标化合物Ⅲa的合成

取中间体Ⅱa 200 mg、2-氟-6-氨基嘌呤154 mg(1.5 eq.)，加入乙腈10 mL、DMF 5滴、碳酸钾140 mg(1.5 eq.)，升温至65 ℃，反应6 h，TLC监测反应完全；旋干乙腈，加入水，搅拌过滤，固体拌样经柱层析纯化，得白色固体化合物Ⅲa 180 mg。

1.2.4.2 目标化合物Ⅲb的合成

取中间体Ⅱb 900 mg、腺嘌呤577 mg(1.5 eq.)，加入乙腈30 mL、DMF 10滴、碳酸钾589 mg(1.5 eq.)，升温至65 ℃，反应6 h，TLC监测反应完全；旋干乙腈，加入水，搅拌过滤，固体拌样经柱层析纯化，得白色固体化合物Ⅲb 850 mg。

1.2.4.3 目标化合物Ⅲc的合成

取中间体Ⅱc 900 mg、腺嘌呤577 mg(1.5 eq.)，加入乙腈30 mL、DMF 10滴、碳酸钾589 mg(1.5 eq.)，升温至65 ℃，反应6 h，TLC监测反应完全；旋干乙腈，加入水，搅拌过滤，固体拌样经柱层析纯化，得白色固体化合物Ⅲc 910 mg。

1.3 目标化合物的抗肿瘤活性评价

分别称取60 mg IC-87114原药、Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc，加入1 mL聚乙烯、1 mL聚氧乙烯蓖麻油-95%酒精(体积比50∶50)溶解，即得浓度为30 mg·mL-1的样品母液，室温避光贮存。实验时将样品母液用蒸馏水稀释至3 mg·mL-1。

将原代培养的小鼠结肠癌细胞CT-26按浓度5×106个/100 μL接种于小鼠的右侧肋部皮下，共接种20只小鼠；待肿瘤长至102.17 mm3时，将小鼠随机分为5组，每组4只，分别给予IC-87114原药、Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc样品母液，以溶剂组作为空白对照，观察肿瘤体积，评价抗肿瘤活性。

2 结果与讨论

2.1 结构表征

中间体Ⅰa：1HNMR(600 MHz,DMSO),δ:9.76(s,1H),7.44(d,J=7.8 Hz,1H),7.21(dd,J=26.2 Hz、7.1 Hz,2H),7.13(d,J=7.4 Hz,1H),6.98(t,J=7.7 Hz,1H),6.58(d,J=8.0 Hz,1H),6.46(d,J=7.4 Hz,1H),4.97(s,2H),2.32(s,3H),2.27(s,3H);LC-MS,m/z:[M+H]+241。

中间体Ⅰb：1HNMR(600 MHz,DMSO),δ:9.76(s,1H),7.46(dd,J=8.5 Hz、5.8 Hz,1H),7.11(d,J=9.6 Hz,1H),7.06～7.00(m,1H),6.98(d,J=7.6 Hz,1H),6.59(d,J=8.0 Hz,1H),6.46(d,J=7.4 Hz,1H),4.98(s,2H),2.31(s,3H),2.28(s,3H);LC-MS,m/z:[M+H]+259。

中间体Ⅰc：1HNMR(600 MHz,DMSO),δ:9.84(s,1H),7.48(d,J=10.5 Hz,1H),7.25(t,J=7.4 Hz,1H),7.04～6.92(m,2H),6.58(d,J=8.0 Hz,1H),6.46(d,J=7.3 Hz,1H),5.03(s,2H),2.30(s,3H),2.25(s,3H);LC-MS,m/z:[M+H]+259。

中间体Ⅱa：1HNMR(600 MHz,DMSO),δ:7.39～7.76(m,7H),4.28(dd,J=55.8 Hz、12.1 Hz,2H),2.74(s,3H),2.07(s,3H);LC-MS,m/z:[M+H]+299。

中间体Ⅱb：1HNMR(600 MHz,DMSO),δ:7.76(t,J=7.8 Hz,1H),7.60(d,J=8.1 Hz,1H),7.55～7.49(m,1H),7.39(d,J=7.4 Hz,1H),7.34(d,J=9.5 Hz,1H),7.24(t,J=8.1 Hz,1H),4.35(d,J=12.3 Hz,1H),4.27(d,J=12.3 Hz,1H),2.74(s,3H),2.08(s,3H);LC-MS,m/z:[M+H]+317。

中间体Ⅱc：1HNMR(600 MHz,DMSO),δ:7.78(t,J=7.6 Hz,1H),7.63(d,J=7.9 Hz,1H),7.49(d,J=8.8 Hz,2H),7.42(d,J=7.0 Hz,1H),7.37(d,J=7.2 Hz,1H),4.40(d,J=12.4 Hz,1H),4.31(d,J=12.4 Hz,1H),2.77(s, 3H),2.07(s,3H);LC-MS,m/z:[M+H]+317。

目标化合物Ⅲa：1HNMR(600 MHz,DMSO),δ:8.05(s,1H),7.78(s,2H),7.62(s,1H),7.48(d,J=22.8 Hz,4H),7.28(dd,J=44.8 Hz、6.0 Hz,2H),5.05(d,J=17.3 Hz,1H),4.69(d,J=17.0 Hz,1H),2.73(s,3H),2.16(s,3H);LC-MS,m/z:[M+H]+416。

目标化合物Ⅲb：1HNMR(600 MHz,DMSO),δ:8.06(d,J=10.9 Hz,2H),7.62(t,J=7.7 Hz,1H),7.55(s,1H),7.39(d,J=8.9 Hz,1H),7.34～7.27(m,2H),7.24(m,3H),5.10(d,J=17.3 Hz,1H),4.81(d,J=17.3 Hz,1H),2.73(s,3H),2.16(s, 3H);LC-MS,m/z:[M+H]+416。

目标化合物Ⅲc：1HNMR(600 MHz,DMSO),δ:8.06(d,J=9.9 Hz,2H),7.62(t,J=7.7 Hz,1H),7.57～7.46(m,2H),7.38～7.30(m,2H),7.24(d,J=7.4 Hz,3H),5.17(d,J=17.3 Hz,1H),4.81(d,J=17.3 Hz,1H),2.73(s,3H),2.13(s,3H);LC-MS,m/z:[M+H]+416。

2.2 抗肿瘤活性

分别给予结肠癌小鼠IC-87114原药、Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc样品母液，观察肿瘤体积，结果如图2所示。

图2 结肠癌小鼠肿瘤体积变化

由图2可知，IC-87114原药、Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc对结肠癌小鼠肿瘤生长的抑制效果均明显优于空白对照组；目标化合物Ⅲa的抑制效果整体优于IC-87114原药以及目标化合物Ⅲb、Ⅲc。初步证实，筛选得到的目标化合物Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc均能明显抑制结肠癌小鼠肿瘤生长，且目标化合物Ⅲa的抑制效果整体较IC-87114原药的更为明显，可进行深入研究。

3 结论

通过对PI3Kδ抑制剂IC-87114的结构进行氟原子取代改造，得到3种氟原子取代位置不同的含氟嘌呤喹唑啉酮类PI3Kδ抑制剂Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc。通过结肠癌小鼠肿瘤体积增长实验发现，合成的PI3Kδ抑制剂均具有抗肿瘤活性，且Ⅲa的抑制效果整体较IC-87114原药的更为明显。