当归挥发油对缺血再灌注致心肌损伤大鼠的心肌保护作用

寿 晔 秦宇芬

1 浙江中医药大学 浙江 杭州 310053

2 湖州市中医院 浙江 湖州 313000

冠状动脉闭塞会使心肌缺血坏死，若及时行再灌注，也会造成缺血再灌注损伤（MIRI）[1]。寻找减轻心肌缺血再灌注损伤机体的药物至关重要。当归药理活性高，主要成分挥发油在心脑血管疾病中疗效显著。本文建立大鼠心肌MIRI模型，探究当归挥发油对MIRI致心肌损伤的保护作用，为临床提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 动物：200～230g雄性SD大鼠24只，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物生产许可证号SCXK(沪)2018-0006。饲养于杭州鹰旸生物科技有限公司动物中心，许可证号为SYXK(浙)2020-0024。自由饮食。

1.2 材料：NF-κB P65(D14E12)XP®、PHOSPHO NF-κB P65(SER536)(93H1)、IκBα(L35A5)MOUSE MAB ANTIBODY（批号：8242S、3033S、4814S，CST）。

1.3 设备：UTP-313型电子天平（上海花潮），EPS300型电泳仪（天能），DM3000型正置英荧光微镜（LEICA），NIKON DS-U3型成像系统（日本尼康）。

1.4 MIRI模型制备：SD大鼠均分为4组，每组6只。用药组以20、40mg/（kg·d），腹腔注射7d，假手术组与模型组注射等体积生理盐水。麻醉，钝性分离暴露气管，连接动物呼吸机。气管插管后分离左颈总动脉，远离左心耳2mm处结扎冠状动脉，诱导缺血，之后取消结扎，再灌注2小时。假手术组仅进行套圈不结扎。

1.5 心脏功能参数：左心室收缩压(LVSP)、舒张末压(LVEDP)、内压最大上升速率(+DP/DTMAX)、内压最大下降速率(-DP/DTMAX)等指标。

1.6 心肌梗死面积：TCC染色，图像处理软件对非梗死区与梗死区进行面积测定并计算评估。

1.7 HE染色：心肌组制备石蜡切片，行HE染色。

1.8 血清心肌酶：取血离心，全自动生化检测仪测定肌酸激酶同工酶（CK-MB),乳酸脱氢酶（LDH)，心肌钙蛋白L（CTNL）活性。

1.9 心肌组织髓过氧化物酶（MPO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD)水平：按说明行ELISA实验。

1.10 心肌组织中炎症因子：ELISA法检测血清白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的水平。

1.11 Western Blot实验：取心肌组织行SDS-PAGE电泳，加入一、二抗孵育。ECL显影，分析蛋白表达。

2 结果

2.1 心脏功能参数：模型组LVEDP显著升高。与模型组比，高剂量组LVSP、+DP/DTMAX、-DP/DTMAX显著增高,LVEDP显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。见图1。

2.2 心肌梗死面积测定：见图1。模型组心肌梗死面积显著升高。与模型组相比，药物处理组心肌梗死面积显著降低（P＜0.05），且高剂量更明显。

图1 MIRI大鼠心脏功能各项参数及心肌梗死面积与药物的关系（±s，n=6）

2.3 HE染色：见图2。模型组细胞整体排列紊乱，出现炎性细胞浸润。与模型组相比，给药组炎性细胞浸润情况改善，细胞排列逐渐恢复整齐。

图2 大鼠肾组织病理学改变（HE染色，400倍）

2.4 血清心肌酶测定：模型组CK-MB、LDH、CTNL指标均上升。与模型组相比，用药组CK-MB、LDH指标均显著下降（P＜0.05或P＜0.01）。见图3。

图3 药物对缺血再灌注大鼠心肌酶活性、心肌组织MPO、MDA、SOD含量的影响（±s，n=6）

2.5 心肌组织中MPO、MDA、SOD水平测定：见图3，模型组MPO、MDA含量升高，SOD含量降低。与模型组比，低剂量组MPO含量降低，高剂量组MPO、MDA含量显著降低，SOD含量显著升高（P＜0.01）。

2.6 心肌组织中炎症因子测定：见图4。模型组血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量升高。与模型组比，药物低剂量组TNF-α含量显著降低，高剂量组IL-1β、IL-6、TNF-α含量均显著性降低（P＜0.01）。

图4 缺血再灌注大鼠心肌组织炎症因子含量（±s，n=6）

2.7 Western Blot：见图5。模型组蛋白表达上升，与模型组比，高剂量组心肌组织中P-NF-κBP65/NF-κBP65、P-IKBα/IKBα蛋白表达下降（P＜0.01）。

图5 心肌组织NF-κBP65、P-NF-κBP65、IκBα、P-IKBα蛋白的表达水平（±s，n=3）

3 讨论

心肌缺血损伤发病因素复杂不一、对机体损害大,研究合适的药物，探究作用机制是目前研究的重点。本实验表明用药组心肌组织变得致密整齐，炎症因子含量也显著降低，提示缺血再灌注会影响心肌纤维的排列，当归挥发油可能通过降低心肌纤维化程度保护心肌组织。

临床常用CK-MB、LDH、CTNL指标是否上升判断患者是否存在急性心肌梗死，而本实验中可用于检验心肌缺血模型是否制备成功。用药组指标下降可能是当归挥发油可以促进心肌组织中的有氧氧化、抑制糖酵解，或是促进LDH转化成丙酮酸，共同起到保护心肌组织的作用。研究表明[2]，组织缺血时氧自由基（OFR)的清除能力会降低，造成心肌细胞损伤。在本实验给药后SOD活性升高，脂质过氧化物MDA含量降低，提示当归挥发油可增强OFR活性，减轻脂质过氧化损伤。

NF-κB是一种核蛋白因子，IκBα的表达依赖于NF-κB的活化，产生的IκBα蛋白进入细胞核内与活化的NF-κB结合，启动靶基因的转录和表达。MIRI时，NF-κB能够调控血清IL-1β、IL-6、TNF-α，使其含量升高，而用药后相关炎症因子含量降低，提示当归挥发油对NF-κB有一定的抑制作用。

综上所述，本实验结果表明当归挥发油对MIRI致心肌损伤大鼠具有一定的保护作用，能够减少心肌损伤和心肌梗死面积，使炎症反应和氧化应激降低，下调PNF-κBP65、P-IκBα蛋白的表达水平。