miR-122-3p靶向VEGFA基因对胰腺癌细胞恶性生物学行为影响的分子机制

宋剑锋，白明辉，刘少朋

(1.前海人寿广州总医院 肝胆外科，广东 广州 511300；2.郑州大学附属洛阳中心医院 肝胆外科，河南 洛阳 471000)

近年来，分子靶向治疗在胰腺癌中的应用是一个研究热点[1]，但肿瘤耐药仍是影响其治疗效果的重要因素之一。血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)可表达于肿瘤组织和正常组织[2-3]，研究表明，VEGFA在胰腺癌中异常高表达，且可通过MAPK/ERK信号通路调控胰腺癌侵袭及转移[4-5]。miR-122-3p是miR-122家族成员之一[6]，且在胃癌、肺癌等多种肿瘤中呈低表达[7-8]。本研究团队前期通过生物学预测软件发现VEGFA基因可能是miR-122-3p潜在的靶基因之一。因此，本研究提出miR-122-3p靶向调控VEGFA基因可能参与胰腺癌进展的假设，进一步探究其分子作用机制，以期为胰腺癌的分子靶向治疗提供新的生物学依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与材料各实验细胞株均购自中科院上海细胞库，胎牛血清、RPMI-1640培养基、DMEM培养基、噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)液、胰酶购自赛默飞世尔科技中国有限公司，Trizol RNA提取试剂盒、定量反转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcriptase-mediated polymerase chain reaction，qRT-PCR)试剂盒(QP115)、反转录试剂盒购自艾美捷科技有限公司，LipofectamineTM2000购自北京索莱宝科技有限公司。荧光定量PCR引物：β-actin上游引物为5’-TACCTCCCAAGTCCTGTATGAG-3’，下游引物为5’-TGAGCAGCATCAAACTGTGTAG-3’；miR-122-3p上游引物为5’-AACAGCACAAACUACUACCUCA-3’，下游引物为5’-UAUUUAGUGUGAUAAUGGCGUU-3’；VEGFA上游引物为5’-ATGCCGGTTCCAACCAGAA-3’，下游引物为5’-GTGGAGGAGCGAGCTGAA-3’。miR-122-3p、miR-con、pcDNA、pcDNA-VEGFA、突变型VEGFA(mutant type VEGFA，MUT-VEGFA)、野生型VEGFA(wild type VEGFA，WT-VEGFA)的构建及测序由苏州态和生物科技有限公司提供。兔抗人基质金属肽酶-2(matrix metallopeptidase-2，MMP-2)、细胞外调节蛋白激酶1(extracellular regulated protein kinase 1，ERK1)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)二抗购于上海普迈生物科技有限公司，自动酶标仪购自上海寰熙医疗器械有限公司(型号SM800)，双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司(型号RG027)，吉姆萨染色液购自达科为生物技术股份有限公司。

1.2 细胞转染与分组将miR-122-3p相对表达量最低的AsPC-1细胞接种于6板孔，至细胞融合度达70%～80%，按照LipofectamineTM2000说明书进行转染，qRT-PCR法测定转染效率。实验分组如下：NC组(细胞不作处理)、miR-con组(转染对照miR-con)、miR-122-3p mimic组(转染miR-122-3p模拟物)、miR-122-3p+pcDNA组(共转染miR-122-3p和空载体pcDNA)和miR-122-3p+pcDNA-VEGFA组(共转染miR-122-3p和pcDNA-VEGFA)。

1.3 qRT-PCR采用Trizol法分别提取各组细胞总RNA，测定其浓度及纯度，将mRNA反转录为cDNA，并行PCR扩增，Bio-Rad CFX96 PCR仪测定miR-122-3p、VEGFA及β-actinmRNA表达水平。设置5个复孔。相对表达量以2-ΔΔCT表示，其中ΔCT为miR-122-3p或VEGFA CT值与β-actin CT值的差值。

1.4 MTT法将各组细胞分别接种于24孔板(5×104个·mL-1)，并分别培养24、48、72 h，弃去上清液后加入无血清RPMI-1640培养液(每孔200 μL)，并加入MTT液(每孔20 μL)，避光培养6 h，加入二甲基亚砜(每孔100 μL)，震荡15 min。待结晶溶解后使用自动酶标仪测定每孔490 nm处吸光度(A490)，并绘制细胞生长曲线。

1.5 平板克隆实验将各组细胞分别接种于6孔板并进行培养，采用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)冲洗后加入40 g·L-1多聚甲醛(每孔1 mL)，固定20 min后用1 g·L-1结晶紫染液染色15 min，漂洗并晾干。倒置显微镜下随机选取5个视野计数细胞，Image J软件统计细胞克隆数。

1.6 细胞划痕实验将各组细胞分别接种于细胞培养板并进行培养(含体积分数5% CO2的恒温培养箱)，用20 μL枪头垂直划过细胞，48 h后拍照，Image J软件测定细胞划痕愈合情况，计算细胞迁移能力。

1.7 Transwell实验Matrigel胶预处理Transwell小室，胰酶消化各组细胞后进行细胞重悬，上部加入20 μL细胞悬液，下部加入60 μL胎牛血清培养基(体积分数为30%)，培养24 h后以PBS冲洗3次，40 g·L-1多聚甲醛固定后用吉姆萨染色液染色，显微镜下计数细胞。

1.8 蛋白质印迹实验分别提取各组细胞总蛋白并调整浓度，行聚丙烯酰胺凝胶电泳后转至聚偏二氟乙烯膜，Western封闭液封闭2 h，PBS清洗3次，分别加入相应一抗，4 ℃下孵育过夜，PBS再次冲洗后加入羊抗兔IgG二抗，37 ℃下孵育2 h，电化学发光液显影后于暗室拍照。Bandscan 5.0软件行灰度分析，设目的蛋白相对表达量为目的蛋白条带灰度值与GAPDH蛋白条带灰度值的比值。

1.9 双荧光素酶报告基因法分别构建WT-VEGFA及MUT-VEGFA的3’UTR荧光素酶基因载体，采用LipofectamineTM2000将miR-122-3p minic和对照miR-con分别与MUT-EVEGFA及WT-VEGFA共转染AsPC-1细胞，培养48 h后用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定各组AsPC-1细胞荧光素酶活性。

2 结果

2.1 miR-122-3p及VEGFA表达miR-122-3pmRNA在胰腺癌细胞株BxPC-3、Capan-1、PANC-1、HPAC、AsPC-1中相对表达量分别为0.64±0.02、0.63±0.07、0.59±0.04、0.60±0.01、0.47±0.13，均低于HPDE细胞株(2.02±0.06)，差异有统计学意义(P<0.05)；VEGFAmRNA在上述胰腺癌细胞中相对表达量分别为5.23±0.19、5.34±0.02、5.30±0.14、5.27±0.27、5.54±0.15，均高于HPDE株细胞(1.09±0.26)，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.2 细胞转染效率测定miR-122-3p mimic组AsPC-1细胞中miR-122-3p相对表达量(3.49±0.18)高于NC组(0.52±0.21)及miR-con组(0.55±0.13)，差异有统计学意义(P<0.05)；miR-122-3p+pcDNA-VEGFA组AsPC-1细胞中VEGFA相对表达量(10.44±0.51)高于NC组(1.09±0.23)及miR-122-3p+pcDNA组(1.07±0.17)，差异有统计学意义(P<0.05)，提示转染成功。见图2。

*P<0.05。

★P<0.05。

2.3 过表达miR-122-3p抑制胰腺癌细胞增殖及克隆形成不同时间点(24、48、72 h)miR-122-3p mimic组AsPC-1细胞活力分别为1.35±0.16、2.78±0.44、3.40±0.71，分别低于NC组的2.02±0.25、5.44±0.18、7.54±0.33及miR-con组的2.00±0.19、5.38±0.11、7.47±0.50，差异有统计学意义(P<0.05)，NC组与miR-con组细胞活力差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。miR-122-3p mimic组细胞克隆数为20.33±3.31，低于NC组(78.11±8.20)及miR-con组(76.49±7.91)，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

图3 过表达miR-122-3p对胰腺癌AsPC-1细胞增殖的影响

*P<0.05。

2.4 过表达miR-122-3p抑制肝癌细胞迁移及侵袭miR-122-3p mimic组细胞迁移率低于NC组(t=-13.121，P<0.001)及miR-con组(t=-12.242，P<0.001)，见表1。miR-122-3p mimic组迁移相关蛋白MMP-2相对表达量低于NC组(t=-7.599，P<0.001)及miR-con组(t=-19.785，P<0.001)，见表1和图5。miR-122-3p mimic组穿膜细胞数低于NC组(t=-41.716，P<0.001)及miR-con组(t=-51.817，P<0.001)，见表1和图6。

表1 转染后不同组别细胞迁移率、MMP-2相对表达量及穿膜细胞数比较

*P<0.05。

图6 过表达miR-122-3p抑制AsPC-1细胞侵袭

2.5 miR-122-3p靶向调控VEGFA表达miR-122-3p与WT-VEGFA共转染AsPC-1细胞后，miR-122-3p mimic组细胞荧光素酶活性低于NC组及miR-con组(0.51±0.13比2.11±0.24、2.08±0.46；t1=-17.552，P1<0.05；t2=-9.279，P2<0.05)；与MUT-VEGFA共转染后，miR-122-3p mimic组与NC组及miR-con组细胞荧光素酶活性差异无统计学意义(1.10±0.22比1.12±0.20、1.09±0.89；t1=-1.243，P1>0.05；t2=-1.936，P2>0.05)。

2.6 过表达VEGFA可逆转miR-122-3p对胰腺癌细胞恶性生物学行为的抑制作用miR-122-3p+pcDNA-VEGFA组AsPC-1细胞在不同时间点细胞活力均高于miR-122-3p+pcDNA组，细胞迁移率、穿膜细胞数均高于miR-122-3p+pcDNA组[细胞迁移率(11.20±1.93)%比(2.35±0.53)%，t=10.609，P<0.001；穿模细胞数(84.39±2.92)个比(22.15±2.50)个，t=49.435，P<0.001]，见图7A、7B、7C。细胞内MMP-2、VEGFA、ERK1、MAPK蛋白表达水平增高，miR-122-3p mimic组细胞内上述蛋白表达低于miR-con组(P<0.001)，见图8A、8B。

A为AsPC-1细胞活力；B为AsPC-1细胞迁移率；C为AsPC-1穿膜细胞数；*P<0.05。

A为电泳条带图；B为条形图；*P<0.05。

3 讨论

miRNA是一类高度保守的非编码小RNA，由20～24 nt组成，广泛存在于真核细胞中[9-10]。作为一种重要的调控因子，miRNA广泛参与多种肿瘤相关基因转录后的调控，在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要的生物学作用[11-12]，因此受到研究者的广泛关注。研究显示，miR-122-3p参与多种疾病的进展，如Zhao等[13]研究显示miR-122-3p参与股骨头坏死的发展进程，Wang等[14]研究显示miR-122-3p可通过靶向A549抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡，Yang等[15]研究显示miR-122-3p可作为药物性肝损伤潜在的毒理学生物标志物，但目前关于miR-122-3p在胰腺癌中作用的相关研究仍较少。

本研究结果显示，miR-122-3p在胰腺癌细胞BxPC-3、Capan-1、PANC-1、HPAC、AsPC-1中表达下调，VEGFA表达上调，初步表明miR-122-3p在胰腺癌中存在差异表达。进一步构建过表达miR-122-3p的胰腺癌AsPC-1细胞，检测结果显示miR-122-3p mimic组细胞增殖、克隆及迁移、侵袭能力均低于NC组及miR-con组，同时MMP-2表达水平也降低，提示过表达miR-122-3p会抑制胰腺癌细胞的恶性生物学行为，并可抑制参与肿瘤进展的MMP-2蛋白的表达。双荧光素酶报告基因检测和蛋白质印迹实验显示，VEGFA与miR-122-3p存在靶向作用关系。为进一步验证此结果，本研究构建过表达VEGFA的miR-122-3p+pcDNA-VEGFA组细胞，细胞实验结果显示miR-122-3p+pcDNA-VEGFA组AsPC-1细胞增殖、克隆、迁移及侵袭等恶性生物学行为均高于miR-122-3p+pcDNA组，这表明过表达VEGFA可逆转miR-122-3p对胰腺癌恶性生物学行为的抑制作用。蛋白质印迹实验结果显示，miR-122-3p+pcDNA-VEGFA组细胞内MMP-2、VEGFA、ERK1、MAPK蛋白表达水平增高，miR-122-3p mimic组细胞内上述蛋白表达水平降低。MMP-2、VEGFA、ERK1、MAPK均是MAPK/ERK信号通路中的重要蛋白，参与胰腺癌的发生发展进程[16-19]。因此，结合上述研究结果，推测miR-122-3p靶向VEGFA抑制胰腺癌细胞的恶行生物学行为可能与抑制MAPK/ERK信号通路的活化有关，但其需要进一步深入研究证实。

综上所述，本研究初步表明miR-122-3p在胰腺癌细胞中低表达，过表达miR-122-3p可抑制胰腺癌细胞的恶性生物学行为，作用机制可能与靶向VEGFA有关，这为寻求胰腺癌新的分子靶点提供了一定参考。