水产品和水体中灿烂弧菌现场可视化环介导等温扩增快检方法的建立及应用

田 卓， 郑秋月， 麻丽丹， 郑文杰， 尚德静， 曹际娟*

(1)辽宁师范大学生命科学学院 细胞生物学专业, 辽宁， 大连 116033；2)大连民族大学生物技术与资源利用教育部重点实验室，辽宁，大连 116600；3)大连海关技术中心，辽宁， 大连 116000；4)丹东海关综合技术服务中心，辽宁， 丹东 118000；5)天津师范大学生命科学学院生物学专业， 天津 300387)

弧菌是海洋环境里最常见的一种细菌类群，广泛分布在河口、海湾、近岸海域的海水和海洋生物的体表及肠道中[1]。对于鱼类、贝类、虾类和蟹类等水产品而言，弧菌属细菌(Vibriospp.)引起的弧菌病已成为全世界范围内的危害最大、流行最广细菌性疾病[2-3]。与此同时，弧菌可以感染包括人类在内的所有动物[4]。在美国，有95%以上食源性疾病、住院和死亡都是由弧菌属病原体所致[5]，这不仅给水产养殖业造成了巨大的经济损失[6]，也造成公共卫生问题的发生。灿烂弧菌是弧菌中的一种具有极强致病性的条件致病菌，可引起刺参(Apostichopusjaponicus)的腐皮综合征、眼斑拟石首鱼(Sciaenopsocellatus)的皮肤溃烂，以及某些牡蛎和贻贝等大规模的死亡[7-11]。

目前水产养殖中，灿烂弧菌的检测是一项非常艰巨的任务。因为弧菌微量，实验室分离培养生长缓慢，易受其他弧菌抑制生长，生化鉴定技术复杂，使其不易在养殖场普及。目前，灿烂弧菌的检测方法主要有以下几种：免疫学检测方法(玻片直接凝集法，双抗原夹心ELISA法，Dot-ELISA，间接荧光快速检测法)和分子生物学方法(PCR检测，核酸探针检测技术)等，免疫学方法检测耗时较长，酶标抗体成本较高；分子生物学方法需要专门的PCR仪及凝胶成像仪等设备，使用成本较高，不能被基层使用者所接受。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是日本生物学家Notomi等[12]于2000年提出的一种新型的核酸扩增方法。该技术在等温条件下完成核酸的扩增，具有高特异性、高效性和低技术要求等优点，已被应用于病原菌检测、猪塞内加谷病毒检测[13-14]与疾病诊断等领域[15-17]，该方法灵敏度和重复性良好，结果判读简易。综上所述，LAMP方法是恒温反应，不需要特殊设备，操作简单、反应灵敏和快速，适合不具备PCR仪等设备的基层单位和养殖场开展弧菌检测。

本研究以灿烂弧菌的toxR基因为靶基因，筛选出1套6条LAMP引物，旨在建立灿烂弧菌的现场可视化LAMP快检方法，包括简便的DNA提取、特异性、灵敏度和重复性试验，最后对建立的方法应用于水产品和环境水体中进行实际样品的检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 所用菌株共9种，包括创伤弧菌(V.vulnificusATCC 27562)，灿烂弧菌(V.splendidusATCC 33125)，拟态弧菌(V.mimicusCICC 21613)，麦氏弧菌(V.metschnikoviiATCC 700040)，费尼斯弧菌(V.furnissiiATCC 35016)，河流弧菌(V.fluvialisCICC 21612)，溶藻弧菌(V.alginolyticusATCC17749)，副溶血弧菌(V.parahaemolyticusATCC 17802)，鳗弧菌(V.anguillarumMCCC 1A07299)。本研究所使用的标准菌种均经过生化鉴定试验并在-80 ℃条件保存。

1.1.2 试剂与仪器 细菌基因组DNA提取试剂盒(货号：DP302，天根生化科技北京有限公司)；煮沸法DNA裂解试剂(货号：No.9182，宝生物工程(大连)有限公司)；DNA恒温扩增试剂盒(货号：051011 M，广州双螺旋基因技术有限公司)；荧光目视检测试剂(钙黄绿素，FD，货号：SLP221，荣研生物科技(中国)有限公司)；3%氯化钠碱性蛋白胨水(货号：CM401B，北京陆桥技术股份有限公司)；LB琼脂(货号：CM159，北京陆桥技术股份有限公司)；超微量分光光度计(Micro Drop，上海宝予德科学仪器有限公司)；实时荧光PCR仪(7500，美国ABI)；实时荧光PCR仪(CFX96，BIO-DL公司)。

1.2 样品处理及基因组DNA的提取

环境水体样品：在环境水体(江河水等)上、中、下段各布置不少于1个监测点，每个监测点采集2份水样，每份500 mL。取1 mL水样加入到事先分装有9 mL的3%氯化钠碱性蛋白胨水(APB)的15 mL EP管中，置于37 ℃恒温PCR箱中培养24 h。取1 mL 增菌培养液，12 000 r/min离心 2 min，弃上清，用于提取DNA。

水产品样品：用流动自来水清洗样品外部的泥沙后，用75%酒精棉球擦洗消毒。对于贝类产品，用灭菌钳将贝类开壳，称取约20 g内容物，放入无菌均质袋；鱼类样品：分别取肝、脾、肾和溃疡病变等处的组织，称取约20 g放入无菌均质袋；对于虾蟹类样品：用解剖剪分离样品，然后称取约20 g内容物，放入无菌均质袋。向均质袋中添加50 mL 0.85%无菌生理盐水，均质3～5 min，使样品充分分散。吸取1 mL样品均质液，加入到事先分装有9 mL的3%氯化钠碱性蛋白胨水(APB)的15 mL EP 管中，置于37 ℃恒温箱中过夜培养。取1 mL 增菌培养液，12 000 r/min离心 2 min，弃上清，用于提取DNA。

上述样品在增菌培养后使用一次性无菌接种环，沾取少量增菌培养液并均匀涂布于TCBS(硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖)琼脂培养基上，置于30 ℃恒温箱中过夜培养。用接种环挑取绿色和黄色的单菌落，在改良纤维二糖多粘菌素B多粘菌素E (modified cellobiose-polymyxin B-colistin, mCPC)琼脂培养基上进行纯化培养，按照FDA发布的BAM-2004提供的第一法，即最大可能数法(most probable number, MPN)用于生化鉴定。

本研究分别采用煮沸DNA裂解法和离心柱提取DNA的方法，对弧菌进行基因组DNA的提取，以优化出快速、适宜于弧菌的DNA提取方法。煮沸DNA裂解法提取步骤：将1接种环细菌培养液加入100 μL的裂解试剂中悬浮菌体，用振荡器混合，95 ℃煮沸10 min；12 000 r/min离心2 min，取上清，-20 ℃冷冻保存备用。离心柱提取DNA法采用商业化提取试剂盒操作步骤进行基因组DNA的提取。

1.3 引物的设计与合成

依据NCBI GenBank数据库中公布的灿烂弧菌toxR基因(GenBank：AY751344.1)作为靶序列，通过蛋白质保守区域分析和基因同源比对，确定toxR基因的保守序列，利用Primer Explore V4软件各设计出了6套LAMP引物。筛选出灿烂弧菌的最佳引物序列。结果正如Table 1所示，均由宝生物工程(大连)有限公司合成。

Table 1 Sequence of LAMP primers for the toxR gene of Vibrio splendidus

1.4 环介导等温扩增反应体系及条件

LAMP反应体系为2×RM反应液12.5 μL，Bst DNA聚合酶1.0 μL，SYTO-9荧光染料0.5 μL(或可视化的钙黄绿素1.0 μL)，每条引物各1.0 μL(内引物终浓度0.4 ～1.6 μmol/L；外引物终浓度0.1～0.2 μmol/L；环引物终浓度0.1～0.8 μmol/L)，DNA模板2 μL，超纯水补齐至总体积25 μL。

通过实时荧光PCR仪或者LAMP实时浊度仪扩增来观察荧光扩增曲线(加SYTO-9 荧光染料)，荧光基团选择SYBR，设置反应条件为63 ℃ 15 s；63 ℃ 45 s作为一个循环，于63 ℃ 45 s处收集荧光信号，45个循环，反应结束后分析荧光扩增曲线结果。

通过可视化观察扩增产物的颜色变化(加钙黄绿素)，设置反应条件为恒温水浴63 ℃保温30 min，然后95 ℃ 2 min终止反应/冰浴终止反应，然后在紫外光下(波长240～260 nm，350～370 nm)观察呈现绿色荧光为阳性结果，无绿色荧光则为阴性结果。

1.5 特异性分析

为评价可视化LAMP检测方法的特异性，根据上述反应体系和条件对创伤弧菌、灿烂弧菌、拟态弧菌、麦氏弧菌、费尼斯弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌的基因组DNA进行扩增反应，进行双平行试验，分别检验本研究可视化LAMP检测方法特异性。

1.6 灵敏度检测

使用超微量分光光度计测定灿烂弧菌基因组DNA的浓度，按照倍比稀释方法将灿烂弧菌的DNA浓度分别调成以下系列浓度：1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL、0.1 fg/μL。每个浓度进行双平行试验，灭菌双蒸水作为阴性对照，按照LAMP反应检测过程，确定可视化LAMP方法的灵敏度。

1.7 重现性检测

将灿烂弧菌的基因组DNA浓度均调至1 ng/μL，以此作为起始浓度，进行10倍倍比稀释，选取灵敏度检测结果中确定的最低检测浓度作为DNA模板，进行LAMP检测，采用20次平行实验，以验证方法的可重复性。

1.8 人工污染模拟检测

将灿烂弧菌 ATCC 33125株液体扩大培养，利用平板计数法调整菌悬液浓度为 1×107CFU/mL，并进行 10 倍梯度稀释，使菌悬液浓度为 1～1×107CFU/mL，取菌液 1 mL 分别均匀涂布在新鲜虾样品表面，室温放置 4 h ，用 1 mL ddH2O 冲洗回收菌液，用 1.2 的方法提取基因组 DNA，用1.4方法进行 LAMP 扩增，得出人工污染样品的检测限。

1.9 在水产品及养殖水域中的实际检测应用

采集655份水产品样品，样品信息如附录A所示，其中餐饮环节中的水产品样品155份，超市流通环节中的水产品样品189份，农贸市场中的水产品样品206份，网店中的水产品样品105份；3-5月水产品样品174份，6-8月水产品样品235份，9-11月水产品样品132份，12-2月水产品样品114份；淡水虾18份(包括青虾、螯虾、河虾)，淡水蟹18份(澄阳湖大闸蟹、中华绒螯蟹)，淡水鱼105份(草鱼、鲢鱼、鲫鱼、鲤鱼、鲶鱼、黑鱼)，海水虾26份(基围虾、南美白虾)，海水蟹27份(飞蟹、三疣梭子蟹)，海水鱼171份(鳕鱼、带鱼、鲅鱼、鲳鱼、鱿鱼、鲈鱼、鲽鱼、章鱼)，贝类189份(鲍鱼、毛蚶、贻贝、香螺、海湾扇贝、牡蛎、文蛤、杂色蛤)，头足类101份(乌贼、短蛸、长蛸、鱿鱼、笔管)。

采集558份水体样品，包括海水样品440份，江河水样品98份，养殖场环境海水样品20份。采用本研究建立的可视化LAMP检测方法，对所采集的样品进行检测，并对经LAMP检出阳性结果的样品进行灿烂弧菌的菌落分离培养和生化鉴定。

1.10 统计学方法

根据实验结果，利用方差分析和卡方检验分析LAMP方法和常规培养法、不同样品中创伤弧菌阳性检出率的检测结果差别的显著性程度。

以P值进行衡量两组差异大小。具体指标如下：

当P值<0.05时，表示两组结果存在显著差异；

当P值<0.01时，表示两组结果的差异极其显著；

当P值>0.05时，表示两组结果无显著差异。

卡方检验分析时，如果卡方值越大，二者偏差程度越大；反之，二者偏差越小；若两个值完全相等时，卡方值就为0，表明理论值完全符合。

2 结果

2.1 煮沸DNA裂解法为最优弧菌基因组DNA提取方法

选取创伤弧菌、灿烂弧菌、副溶血性弧菌和鳗弧菌的菌株增菌液，采用煮沸DNA裂解法和离心柱DNA纯化法分别提取基因组DNA，使用超微量分光光度计测定吸收值及计算浓度，核酸纯度及浓度测定结果正如Table 2所示。两种DNA提取方法的A260/A280比值、A260/A230比值的核酸纯度方差分析结果见Fig.1和Fig.2。由Fig.1-2可知，无论采取何种提取方法，核酸纯度的指标值(A260/A280)均能达到1.5及以上，该两种方法之间无显著差异(P>0.05)，基本满足正常的核酸检测需求。然而，该两种方法的指标值(A260/A230)之间存在显著性差异(P<0.05)，通过Table 2的测定值可知，煮沸法中A230的测定值显著上升，说明残留较多碳水化合物，后续进行LAMP扩增时需要对模板DNA进行稀释，以降低其他成分的干扰。

Fig.1 The four Vibrio genomic DNA purity index value (A260/A280) Genomic DNA was extracted by the boiling DNA lysis method and spin column DNA purification method, respectively. The A260/A280 ratio of the two methods of DNA extraction was analyzed by anOVA

Fig.2 The four Vibrio genomic DNA purity index value (A260/A230) Genomic DNA was extracted by the boiling DNA lysis method and spin column DNA purification method, and the ratio of A260/A230 was analyzed by variance of nucleic acid purity

Table 2 Absorption value and purity value of four Vibrio genomic DNA

不同DNA提取方法的LAMP扩增效果。通过LAMP荧光扩增曲线分析反应结果(加SYTO-9 荧光染料)如Fig.3所示，通过紫外光下观察产物颜色浊度变化结果(加钙黄绿素)如Fig.4所示。由Fig.3和Fig.4结果可见，采用两种不同方法提取的灿烂弧菌DNA，通过LAMP反应均能产生典型的荧光扩增曲线(Fig.3，加SYTO-9 荧光染料)，且Ct值基本一致。通过紫外光下观察产物颜色浊度变化，也均可以产生典型的绿色荧光阳性结果(Fig.4，加钙黄绿素)。

不同DNA提取方法的LAMP扩增效果。通过LAMP荧光扩增曲线分析反应结果(加SYTO-9 荧光染料)正如Fig.3所示。

Fig.3 LAMP results of V.splendidus by different extraction methods LAMP amplification effects of different DNA extraction methods. The reaction results were analyzed by LAMP fluorescence amplification curve

通过紫外光下观察产物颜色浊度变化结果(加钙黄绿素)见Fig.4所示。

Fig.4 Visual detection of different extraction methods of V.splendidus under the UV light LAMP amplification effects of different DNA extraction methods. The color turbidity of the product was observed under ultraviolet light. 1,2：Genomic DNA samples of Vibrio splendidus were extracted by the spin column method；3,4：Genomic DNA of Vibrio splendidus was extracted by the boiling method；5,6：Water control

由Fig.3和Fig.4的结果表明，采用2种不同方法提取的灿烂弧菌DNA，通过LAMP反应均能产生典型的荧光扩增曲线(Fig.3，加SYTO-9 荧光染料)，且Ct值基本一致。通过紫外光下观察产物颜色浊度变化，也均可产生典型的绿色荧光阳性结果(Fig.4，加钙黄绿素)。

2.2 第1套引物出峰较早且无非特异性扩增

通过LAMP荧光扩增曲线分析(加SYTO-9 荧光染料)，灿烂弧菌的LAMP引物筛选结果见Fig.5所示。其中，阳性对照分别为灿烂弧菌，阴性对照为副溶血性弧菌。由Fig.5的结果显示，灿烂弧菌toxR基因序列设计的6套引物进行LAMP反应后结果为：第1、2、3套引物，灿烂弧菌阳性对照的出峰时间约为13、15、27 min，阴性对照均无扩增；第4套引物灿烂弧菌阳性对照的出峰时间约为10 min，但阴性对照在50 min出现翘尾情况；第5套引物较晚的时间才出现微弱的扩增；第6套引物无扩增。综合以上结果，选择出峰较早，且无非特异性扩增的灿烂弧菌第1套引物(序列见Table 1)用于后续试验。

Fig.5 LAMP assay for the toxR gene of Vibrio brilliant by six sets of primers The results of LAMP primers were analyzed by the LAMP fluorescence amplification curve

2.3 特异性分析结果良好

采用Table 1中优化筛选后的LAMP引物进行特异性检测，分别对创伤弧菌、灿烂弧菌、拟态弧菌、麦氏弧菌、费尼斯弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌及副溶血弧菌8种弧菌进行LAMP扩增。反应结束通过观察荧光扩增曲线(加SYTO-9 荧光染料)和紫外光下观察扩增产物的颜色变化(加钙黄绿素)，分析检测结果，验证本方法的特异性。特异性检测结果显示，经LAMP检测，灿烂弧菌有特异性扩增，2次重复结果相一致，其他弧菌的扩增均为阴性。荧光扩增曲线结果见Fig.6，紫外光下扩增产物的颜色浊度变化结果见Fig.7。说明本研究设计的灿烂弧菌LAMP引物均具有良好的特异性。

Fig.6 The specificity of detection of V.splendidus by LAMP fluorescence amplification curve analysis LAMP amplification was performed on eight kinds of vibrio, and the fluorescence amplification curve was observed after the reaction A、B: V.splendidus；C～J: other 7 kinds of Vibrio

Fig.7 The specificity of visual LAMP detection of V.splendidus under UV light Eight Vibrio species were amplified by LAMP. After the reaction, the color changes of amplified products were observed under ultraviolet light

2.4 灵敏度达到10-9g/L

将灿烂弧菌8个不同浓度的基因组核酸作为扩增反应模板，LAMP反应荧光扩增曲线结果(加SYTO-9 荧光染料)见Fig.8，紫外光下扩增产物的颜色浊度变化结果(加钙黄绿素)见Fig.9。由Fig.8的结果显示，当灿烂弧菌的浓度在10 fg /L(10-9g/L)及以上时，均有荧光扩增曲线出现且结果稳定，当为1 fg /L的浓度时均只能概率性的检出且结果不稳定；由Fig.9的结果显示，10 fg /L(10-9g/L)及以上浓度的灿烂弧菌，紫外光下均观察到扩增产物呈现绿色荧光浊度变化，而当浓度为1 fg/μL时浊度变化不显著。因此，综上结果，灿烂弧菌的LAMP方法检测灵敏度为10-9g/L，且荧光扩增曲线和紫外光下观察扩增产物的颜色变化灵敏度结果基本一致。

Fig.8 The sensitivity test for detection of V.splendidus by the LAMP fluorescence method Eight different concentrations of genomic nucleic acids of V.splendidus were used as amplification reaction templates for LAMP detection. A:1ng/μL; B: 100pg/μL; C: 10pg/μL; D: 1pg/μL; E: 100 fg/μL; F: 10 fg/μL; G: 1fg/μL; H: 0.1fg/μL; I:blank

Fig.9 LAMP visual detection of V.splendidus sensitivity under the UV light Eight different concentrations of genomic nucleic acids of V.splendidus were used as amplification reactions by LAMP to observe the changes of color turbidity of amplified products under ultraviolet light

2.5 检测重复性良好

重复试验的荧光扩增曲线结果见Fig.10。结果显示，2种弧菌的20次重复检测结果一致且均为阳性，而且出峰时间短、扩增曲线完整，说明采用LAMP方法检测灿烂弧菌具有良好的重复性和稳定性。

Fig.10 Repeatability test results for 10 fg/μL DNA of V.splendidus The LAMP reaction was performed using genomic DNA with the lowest detection concentration of 10 fg/μL as the template and 20 replicates were performed

2.6 人工污染样品的检出限为10 CFU/mL

灿烂弧菌 ATCC 33125株的菌液梯度稀释后，涂于新鲜虾体表进行污染模拟。结果正如Fig.11所示, 污染菌液浓度为10～1×107CFU/mL的样品检测结果均为阳性，浓度为1 CFU/mL的样品结果为阴性。结果表明，人工污染模拟实验得到最低检测限为10 CFU/mL。

Fig.11 Limits of detection of artificially contaminated samples The gradient dilution of V.splendidus ATCC 33125 strain was applied to the surface of fresh shrimps to simulate the contamination

2.7 实际样品中的检测结果良好

采用本方法对采集的水产品样品和水体样品进行实际检测应用。经LAMP检测，在655份水产品样品中，有3份样品检出灿烂弧菌，阳性检出率为0.46%(3/655)。在558份水体样品中，有3份样品检出灿烂弧菌，阳性检出率为0.54%(3/558)。并且通过比较基于荧光扩增曲线(加SYTO-9 荧光染料)，以及基于可视化观察扩增产物的颜色变化(加钙黄绿素)，所建立的LAMP方法检测水产品样品和水体样品的结果完全一致。

对于所采集的水产品样品和水体样品，同时采用实时荧光PCR方法[4]进行验证，结果符合率为100%。同时，进行灿烂弧菌的菌落分离培养和生化鉴定，经鉴定，灿烂弧菌阳性菌株检出率为66.67%(P= 2.5*10-10)。

2.7.1 不同种类样品中贝类中检出灿烂弧菌 655份水产品样品中，淡水虾蟹36份、淡水鱼105份、海水虾蟹53份、海水鱼171份、贝类189份、头足类101份，LAMP检测结果见Table 3所示。灿烂弧菌阳性样品种类是贝类，阳性样品数为3份，检出率为1.59%(3/189)。推测贝类更易富集弧菌。

558份水体样品中，海水样品440份，江河水98份，养殖场水20份，LAMP检测结果见Table 4所示。海水、江河水、养殖场水中灿烂弧菌阳性样品数分别为3份、0份和0份，阳性检出率分别为0.68%(3/440)、0%(0/98)、0%(0/20)。经卡方检验分析，海水样品与江河水样品阳性检出率无统计学差异(χ2 =0.672，P> 0.05)，海水样品与养殖场水样品阳性检出率无统计学差异(χ2 =0.137，P> 0.05)。

Table 3 LAMP detection of V.splendidus in different aquatic products

Table 4 LAMP detection results of V.splendidus in water samples

2.7.2 6～8月样品中检出灿烂弧菌 弧菌是喜温性细菌。有研究表明，随着水温的上升，弧菌的检出率呈现上升趋势。因此，夏季弧菌的检出率最高。本研究的检测结果也证实了这种情况，结果见Table 5所示，灿烂弧菌阳性检出率最高的是6～8月，检出率为1.28%(3/235)。

Table 5 LAMP detection of V.splendidus in different months

2.7.3 农贸市场中样品检出灿烂弧菌 在中国，多数农贸市场为开放式的管理方式，不同种类的商品之间存在交叉污染的情况。与农贸市场相比，超市管理会相对规范，减少了商品间污染的机会。因此，农贸市场中灿烂弧菌的污染情况会高于超市。本文的检测结果也证实了这种情况，结果见Table 6所示，农贸市场中灿烂弧菌的检出率为1.46%(3/206)。

Table 6 LAMP detection of V.splendidus in different sampling links

3 讨论

我国水产养殖业有着悠久历史，近年来也逐渐向养殖种类多样化、养殖模式多元化发展。然而，集约化生产容易导致生物病害的发生，管理滞后导致病害问题日益明显[18-19]，尤其是弧菌属细菌(Vibriospp.)等致病菌引起的细菌性病害。弧菌属细菌能引发鱼、海参、虾、蟹等患弧菌病(Vibriosis)，其中灿烂弧菌被认为是鱼类重要致病菌之一，严重影响了海水养殖业的可持续发展。

目前，对灿烂弧菌检测方法已有相应的研究，例如免疫学检测技术，PCR检测技术，核酸探针检测技术等，但是这些技术普遍存在操作繁琐、设备昂贵、灵敏度和特异性不理想、耗时长等不足，限制了其在基层的应用推广。环介导等温扩增(LAMP)技术具有操作简单、灵敏度高、特异性强、设备和操作人员要求低等优点。针对海水养殖弧菌性病原菌的LAMP检测技术已有相关研究，包括对溶藻弧菌[20-22]、副溶血性弧菌[23-25]、创伤弧菌[26-30]、鲨鱼弧菌[31]和哈维氏弧菌[32]等，但对于灿烂弧菌的LAMP检测方法[3]和实时荧光PCR检测方法[11]的研究较少。

本研究选择toxR作为靶基因设计引物。这是因为虽然在现有的文献中，多使用16 s rRNA、gyrB、toxR作为靶基因，但是弧菌属(Vibrio)的其他物种，也多使用16 s rRNA与gyrB作为靶标序列，而toxR与16 s rRNA、gyrB相比较，其特异性相对较好，有更多的碱基差异，方便引物的设计。

DNA提取方法结果表明，煮沸DNA裂解法中残留碳水化合物并不能影响LAMP反应，同时具备提取时间短、成本低、方便操作等优势。因此，选取煮沸DNA裂解法进行弧菌基因组DNA的提取。

本研究建立了基于观察扩增产物颜色变化(加钙黄绿素)的可视化LAMP检测方法用于灿烂弧菌检测，对655份水产品样品和558份水体样品进行检测，灿烂弧菌检出率为0.46%和0.54%，并且在不同季节、农贸市场的水产品中有检出灿烂弧菌。结果表明，该方法与实时荧光PCR方法的检测结果符合率为100%，与经典的分离培养鉴定灿烂弧菌符合率为66.67%(p= 2.5×10-10)。可视化LAMP检测方法的阳性检出率显著高于经典的分离培养鉴定方法，具有统计学意义。

由此可见，预防水产品和水体环境中灿烂弧菌的污染依然非常重要，建立一种灵敏度高、操作简单、快速高效的灿烂弧菌快速检测方法是十分必要的[33]。根据本研究的实际应用结果，所建立的水产品及水体中灿烂弧菌现场可视化LAMP检测方法，可以快速检测灿烂弧菌，特别是可视化检测仅需要恒温器即可完成，是简单且经济的，对水产养殖中灿烂弧菌的及时控制及预防具有重要意义。