Hp 感染性胃癌组织TLR2、TLR4 表达及其临床意义

邹新梅 王 洋 钟丽萍 李 雷

我国是胃癌的高发国家之一，年新发病例约40万例，2009 年数据统计显示，胃癌年新发病例约占全部癌症的7.8%，约99 万例[1]。既往研究证实，胃黏膜长期慢性炎症刺激是导致胃癌发生发展的独立危险因素之一[2-3]。幽门螺杆菌（helicobacter pylori，Hp）可介导CagA 基因及对上皮细胞保护层具穿透能力的HtrA 的蛋白酶等毒性因子表达，参与激活胃黏膜组织免疫及炎症反应引发黏膜受损，甚至萎缩，故Hp 感染与胃癌发生发展的关系逐渐受到广泛的关注[4]。Toll 样受体（toll-like receptor，TLR）家族由损伤相关分子模式和多种特异性识别病原相关分子模式的跨膜蛋白组成，可识别真菌、细菌和病毒等微生物，其中TLR2 和TLR4 与Hp 识别、激活的下游炎性因子表达及癌前病变密切相关[5]，但在胃癌患者中Hp 的感染是否与TLR2 和TLR4 的表达相关，且其异常表达的临床意义仍缺乏相关报道。基于此，本研究以胃癌患者为研究对象，以期探讨感染和非感染Hp 的胃癌患者TLR2 和TLR4 的表达差异及临床意义，旨在更好地了解Hp 感染与胃癌发生发展的机制，为后续临床早期筛查提供新思路。

1 临床资料

1.1 一般资料 选取浙江省湖州市第三人民医院和湖州市中心医院2013 年9 月—2015 年3 月收治的胃癌患者128 例[取病灶组织128 例（病灶组）和癌旁正常组织90 例（癌旁组），癌旁组织与病灶组织距离>2cm]和胃黏膜增生患者（增生组）68 例。本次研究所纳入病例经医院伦理委员会批准，审批号：（2018）伦审第037 号。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：（1）均在术后经病理检查确诊为胃癌；（2）患者自愿签署知情同意书；（3）入组前4 周未进行抗Hp 治疗；（4）预计生存期>6个月者。排除标准：（1）伴严重肝、肾功能障碍者；（2）胃癌复发者；（3）伴严重心脑血管疾病者。

2 方 法

2.1 Hp 感染情况检查 采用C-14 呼气试验测定入组患者Hp 感染情况，具体方案为：（1）患者需口服C-14 尿素胶囊，而后由科室责任护士负责采集患者呼出气体100mL，并C-14 红外线能谱仪（北京格物时代科技发展有限公司）进行检测，DOB 值>2.5 则判断为阳性。

2.2 TLR2、TLR4 表达检测 取适量石蜡切片，常规脱蜡水化，并以3min/次的频率进行PBS 冲洗，共冲洗3 次。将组织切片置于耐高温塑料切片架上，采用微波加热pH=6.0 的柠檬酸盐缓冲液，待沸腾后放入已沸腾的缓冲液中，10min 后以3min/次的频率冲洗2 次，随后采用PBS 进行2 次冲洗，每次3min。室温下孵育10min。采用免疫组化染色（SP）检测TLR2、TLR4 的表达情况。方法为：加一抗1∶200 后4℃过夜，次日加辣根过氧化物酶进行二抗孵育。采用已知TLR2、TLR4 阳性切片作为阳性对照。SP 检测试剂盒购置于上海研启生物科技有限公司。结果判定：保证每个视野下需不低于100 个细胞，并随机选取5 个400 倍视野。阳性判定方法：两项分数相乘结果＞1 即阳性，无色为0 分，浅黄色着色味1 分，棕黄色着色味2 分；视野内阳性细胞百分比≤10%为0 分、＞10%～25%为1 分、＞25%～50%为2 分、＞50%～75%为3分、＞75%为4 分。并分析TLR2、TLR4 的阳性表达与胃癌患者年龄、TNM 分期、分化程度、病理分型和淋巴结转移的关系；采用Cox 回归模型分析Hp 感染性胃癌患者预后的影响因素；采用ROC 曲线分析预测Hp 感染性胃癌患者的价值；采用Kaplan-Merier 进行生存分析。

2.3 随访方案 患者出院后采用电话联系形式对其进行为期5 年的随访，以患者死亡作为终点事件，记录并统计随访人员生存期。

2.4 统计学方法 应用SPSS 19.0 统计分析软件处理数据，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料以率（%）表示，两组间比较采用χ2检验。P<0.05 认为差异有统计学意义。采用Person 进行相关性分析；预后影响分析采用Cox 回归模型；并绘制受试者工作曲线（ROC 曲线）。采用Kaplan Meier 法进行生存分析，组间比较采用Log-rank 检验，P<0.05 认为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 三组受试者一般资料比较 三组受试者一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

表1 三组受试者一般资料比较

3.2 三组受试者TLR2、TLR4 表达阳性率比较 胃癌组TLR2、TLR4 的阳性率均显著高于癌旁组和增生组（P<0.05），见表2。

表2 三组受试者TLR2、TLR4 表达阳性率比较[例（%）]

3.3 Hp 阳性和Hp 阴性胃癌患者TLR2、TLR4 表达阳性率比较 Hp 阳性组TLR2、TLR4 的阳性率均显著高于Hp 阴性组（P<0.05），见表3。

表3 Hp 阳性和Hp 阴性胃癌患者TLR2、TLR4 表达阴性率比较[例（%）]

3.4 TLR2、TLR4 表达与胃癌临床病理特征的关系Spearman 相关性分析结果显示，Hp 感染水平与TLR2（r=0.697，P=0.00）和TLR4（r=0.684，P=0.00）均呈显著正相关（P<0.05）。TNM 分期越高、分化程度越高和伴淋巴结转移者，其Hp 阳性率、TLR2 和TLR4的阳性率更高（P<0.05），见表4。

表4 TLR2、TLR4 表达与胃癌临床病理特征的关系[例（%）]

3.5 Hp 感染性胃癌患者预后Cox 回归分析 以Hp感染性胃癌患者预后死亡为因变量，以TNM 分期（Ⅰ-Ⅱ期=0，Ⅲ-Ⅳ期=1）、分化程度（低+中分化=0，高分化=1）、淋巴结转移（无转移=0，转移=1）、TLR2阳性、TLR4 阳性为因变量纳入多因素Cox 回归模型，结果显示，TNM 分期Ⅲ-Ⅳ期、高分化、淋巴结转移、TLR2 阳性、TLR4 阳性均为影响胃癌患者死亡的独立危险因素（P＜0.05），见表5。

表5 Hp 感染性胃癌患者预后Cox 回归分析

3.6 TLR2、TLR4 预测Hp 感染性胃癌预后的ROC曲线分析 ROC 结果显示，拟合TLR2、TLR4 预测胃癌患者预后的灵敏度和特异性高达92.31%和91.67%。见表6 和图1。

表6 TLR2、TLR4 预测Hp 感染性胃癌预后的ROC 曲线分析

图1 TLR2、TLR4 预测Hp 感染性胃癌预后的ROC 曲线分析注：TLR2 为Toll 样受体2；TLR4 为Toll 样受体4；Hp 为幽门螺杆菌

3.7 TLR2、TLR4 的表达与生存期的关系 入组患者均随访60 个月，TLR2 阳性患者中位生存期21 个月，TLR2 阴性患者中位生存期36 个月；TLR4 阳性患者中位生存期23 个月，TLR2 阴性患者中位生存期37 个月（P＜0.05）。

4 讨论

胃癌发病率高居我国消化道恶性肿瘤榜首。研究发现，我国居民筛查意识较差，而胃癌早期多无特异性症状，故就诊时病情多已进展至晚期[6]。手术+放化疗的综合方案是现阶段胃癌的主要治疗方案，但晚期胃癌患者术后复发和远处转移风险显著更高，5年生存率不足25%。世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）认为，Hp 是导致胃癌发生发展的Ⅰ类致癌因素[7]。本次研究发现，胃癌患者中Hp 阳性率显著高于阴性率，提示伴Hp 感染者可能具更高胃癌发病风险。本课题发现，TNM 分期越高、分化程度越高和有淋巴结转移者，其Hp 阳性率明显更高，提示在Hp持续感染可能为胃癌进行性发展的独立危险因素。新近研究发现，胃黏膜炎症反应的启动和持续恶化参与介导了胃癌的癌前病变和病情恶化，而Hp 感染可能为胃黏膜炎症反应的启动因素[8]。

Toll 样受体在人体中包含11 种亚型，是机体天然免疫系统中模式识别受体，可识别DAMPs 和PAMPs，其中TLR2 和TLR4 是主要位于质膜上的Toll 受体蛋白，可通过调控下游MyD88，进而激活NF-κB 引发下级炎症链级反应[9]。Jenkins 等[10]证实，TLR2/4 表达上调后可分泌IFN-γ，引起T 细胞的增殖扩散，而炎症通过TLR2/4 诱导的内源性介质进而参与肿瘤的发生发展。动物实验发现，TLR2/4 mRNA高表达于肝癌组织，且在分化程度更高的胃癌细胞中表达明显更高[11]。本研究发现，胃癌组TLR2/4 的阳性率显著高于癌旁组和增生组，这预示着TLR2/4的过表达激活的炎症反应可能促进了胃癌的发生和发展，但二者的表达是否与Hp 感染性胃癌有关仍尚未明确。

本实验结果显示，Hp 阳性组TLR2/4 的阳性率显著高于Hp 阴性组，提示Hp 持续感染诱发的炎症反应可能与TLR2/4 的表达上调有关。考虑TLR 家族作为机体天然免疫调节的关键蛋白，在病毒和细菌等外来应激作用下可激活机体炎症反应从而促进胃癌发生发展。研究发现，Hp 感染相关性胃炎TLR2/4基因突变型表达量明显低于野生型，这预示着TLR2/4 可作为Hp 感染患者进一步筛查的血清标志物[12]。相关性分析结果发现，Hp 感染与TLR2/4 的表达密切相关，表明Hp 感染引发的慢性炎症可能通过激活TLR2/4 信号通路表达促进了胃癌的发生发展。我们发现Ⅲ－Ⅳ期比Ⅰ－Ⅱ期、高分化比分化程度较低、伴淋巴结转移比无淋巴结转移者TLR2/4 的阳性率前者均明显更高，这与Paarnio 等[13]在结直肠癌患者中研究结果基本一致。考虑Hp 感染后诱发的炎症反应激活TLR2/4 的表达，使正常组织异常裂解和凋亡引起癌前病变，且在肿瘤发展过程中持续的炎症微环境使TLR2/4 长期处于高水平表达，这有利于激活下游β-catenin 基因、p53 和PIK3CA 等增殖、侵袭基因的表达[14]。Fan 等[15]证实，肝癌患者肿瘤细胞中TLR2/4 的过表达与增殖相关基因表达密切相关。为进一步证实我们以预后死亡为因变量，TNM 分期、分化程度、淋巴结转移、TLR2 阳性和TLR4 阳性为因变量纳入多因素Cox 回归分析发现，上述因素均为影响胃癌患者预后的独立危险因素。考虑在引发胃癌患者预后死亡因素中肿瘤的复发与远处转移扮演了尤为重要的角色，而随分化程度和淋巴结转移的发展，患者经手术切除病灶后由于肿瘤微环境的形成，若病灶未完全根除其复发及复发后形成转移灶风险明显更高[16]。邓靖宇和梁寒[17]报道显示，淋巴结转移是影响胃癌患者预后的独立危险因素。为进一步明确TLR2/4 在胃癌病情评估中的价值，以预测概率做ROC 曲线发现，联合TLR2/4 的诊断敏感度和特异性高达92.31%和91.67%，证实TLR2/4 可作为评估胃癌患者病情的潜在血清标志物。我们随访发现，Hp阳性组生存期明显短于阴性组，进一步证实TLR2/4不仅可用于胃癌的早期评估，还可作为预测其预后的可靠血清标志物。

综上所述，Hp 感染是导致胃癌发生发展的高风险因素，其可通过激活TLR2 和TLR4 的表达持续激活胃黏膜炎症反应，从而参与肿瘤的发生及恶性发展，且TLR2 和TLR4 可作为胃癌早期诊断及预后评估的可靠血清标志物，但本次实验仍存在样本量过少的不足之处，今后需进一步设置高质量的前瞻性实验予以论证。