蜡样芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌发酵条件的优化

■王劲松 关 峰 王学文 许 丽 刘佐民* 张 雷 董 玲

(1.中国食品药品检定研究院，北京 102629；2.东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江 哈尔滨 150030；3.辽宁省农牧业机械研究所有限公司，辽宁 沈阳 110036）

抗生素作为饲料添加剂的使用影响了我国畜牧业的可持续发展，因而调整饲料添加剂的研发方向，寻找无毒副作用、无残留、安全的微生态制剂，成为近年来研究的热点[1-2]。蜡样芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，大多存在于土壤中，有的可以产生毒素，致人腹泻[1-2]。无毒的蜡样芽孢杆菌可以产生活性较强的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，因而在动物生产中广泛应用。研究发现在动物日粮中添加蜡样芽孢杆菌可以提高饲料转化率，增强免疫力，提高断奶仔猪的日增重，降低腹泻率和死亡率[3-4]。Castrejón等[5]研究发现在银鲶鱼日粮中添加含量为4×1011CFU/g 的蜡样芽孢杆菌和4×1011CFU/g枯草芽孢杆菌合剂后，可以提高银鲶鱼的生产性能，促进肠道绒毛的生长，加强黏液分泌细胞的活动。Hafner 等[6]在受T-2毒素污染的兔日粮中添加蜡样芽孢杆菌（200 mg/kg）和甘露寡糖（2 g/kg）后发现，蜡样芽孢杆菌和甘露寡糖单独或联合使用，都可以缓解T-2 毒素对于兔淋巴细胞的损伤作用。而乳酸菌作为常见的动物微生态添加剂，在动物饲料中添加后，可以通过产生有机酸降低肠道内pH，以及产生细菌素和降解氨基酸产生吡啶多胺衍生物等作用来抑制病原菌的增殖，增强动物肠道酶的活力和动物的免疫力，进而提高动物的日增重[7-10]。Jin 等[11]研究发现饲喂乳酸杆菌制剂可以极显著地增加肉鸡的日增重。而Mountzouris等[12]研究发现，在鸡饲料中添加含有乳酸杆菌、双歧杆菌、肠球菌的复合微生态制剂和盐霉素钠，6 周后乳酸菌组和抗生素组的生长性能差异不显著，但是饲料转化率明显高于对照组（基础日粮组），且益生菌组的α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶活性提高。在动物生产中，动物微生态制剂必须达到一定的活菌数才能取得很好的应用效果[13]。因而本试验通过对蜡样芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌的生长条件进行优化，旨在为大幅度提高发酵水平，提高有效活菌数。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），购于黑龙江省微生物研究所。嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus），由东北农业大学食品工程学院提供。

1.1.2 培养基

1.1.2.1 蜡样芽孢杆菌培养基

①液体培养基：酵母粉蛋白胨培养基（蛋白胨10 g、酵母粉5 g、葡萄糖5 g、NaCl 5 g、磷酸氢二钾0.55 g、硫酸锰0.25 g、纯化水1 000 mL，pH 7.0）。

②固体培养基：液体培养基中加1%的琼脂。

1.1.2.2 嗜酸乳杆菌培养基

①液体培养基：MRS 培养基（胰蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、柠檬酸铵2 g、葡萄糖20 g、磷酸二氢钾2 g、乙酸钠5 g、吐温-80 1 g、硫酸镁0.5 g、硫酸锰0.2 g、纯化水1 000 mL，pH 6.5）。

②固体培养基：MRS液体培养基加2%的琼脂。

③番茄汁的制备：将番茄洗净，称取500 g 在锅中打碎，加水500 mL，煮沸30 min，定容至500 mL，过滤，115 ℃（0.1 MPa）高压灭菌20 min后保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 蜡样芽孢杆菌培养条件的优化

1.2.1.1 种子液的制备

①菌种活化：将保存的菌种转接到酵母膏蛋白胨琼脂液体培养基，30 ℃培养24 h，备用。

②一级菌种：将4 mL活化的菌种再次转接在酵母膏蛋白胨琼脂液体培养基中，30 ℃培养24 h。

③二级菌种：取4 mL 一级种子液，接入盛有200 mL酵母膏蛋白胨液体培养基的250 mL的三角瓶中，置摇床中，转速为200 r/min，30 ℃振荡培养24 h。

1.2.1.2 液体发酵原料配比的优化

以酵母粉蛋白胨培养基为基础，按照L18（37）正交试验表，分配各因素及水平，具体设计见表1。接种2%菌液（体积比）于培养基，在30 ℃、200 r/min，摇瓶培养24 h。

表1 正交试验因素及水平表

1.2.1.3 最佳发酵时间的确定

按照优化得到的发酵原料配比，取4 mL 种子液加入装有200 mL 发酵培养基的锥形瓶中，于30 ℃，200 r/min，摇瓶培养，每2 h测定一次OD值，绘制生长曲线，找出蜡样芽孢杆菌的最佳发酵时间。

1.2.1.4 验证试验

通过由正交试验设计得到的发酵原料最优配比，结合生长曲线确定的最佳发酵时间，将蜡样芽孢杆菌30 ℃培养24 h后计数，以酵母粉蛋白胨固体培养基为计数培养基，将培养后的菌液稀释到合适倍数，涂布到平板上，测定其活菌数从而验证蜡样芽孢杆菌发酵的最优条件。

1.2.2 嗜酸乳杆菌发酵条件的优化

1.2.2.1 种子液的制备

①菌种活化：将保存的菌种转接到MRS 琼脂斜面培养基，37 ℃厌氧培养箱培养24 h，备用。

②一级菌种：将4 mL 活化的菌种再次转接在MRS液体培养基中，30 ℃培养24 h。

③二级菌种：取4 mL 一级种子液，接入盛有200 mL MRS液体培养基的250 mL的三角瓶中，置摇床中，转速为200 r/min，30 ℃振荡培养24 h。

1.2.2.2 液体发酵原料配比的优化

以MRS 培养基为基础培养基，优化嗜酸乳杆菌生长所需的N 源（添加量为1%）、C 源（添加量为2%）及营养促进因子（番茄汁）的添加量。按照L9（34）正交试验表，分配各因素及水平，具体设计见表2。

表2 正交试验因素及水平表

将发酵原料按L9（34）正交试验表配制好后，取200 mL 液体培养基于250 mL 锥形瓶中，用封口膜封口，115 ℃（0.1 MPa）高压灭菌20 min。取4 mL 种子液加入装有200 mL发酵培养基的锥形瓶中放入厌氧培养箱，37 ℃培养24 h。培养菌液在600 nm比色，以未接菌的MRS培养基为空白调零，测定吸光度。

1.2.2.3 嗜酸乳杆菌最佳发酵时间的确定

按照1.2.2.2优化得到的发酵原料配比，取4 mL种子液加入装有200 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中，放入厌氧培养箱，37 ℃静置培养。按上述方法每2 h测定一次吸光度，绘制生长曲线，找出适宜的培养时间。

1.2.2.4 验证试验

通过由正交试验设计得到的发酵原料最优配比，结合生长曲线确定的最佳发酵时间，将嗜酸乳杆菌培养一定时间后，以MRS固体培养基为计数培养基，将培养后的菌液稀释到合适倍数，涂布到平板上，37 ℃厌氧培养24 h计数，测定其活菌数从而验证嗜酸乳杆菌发酵的最优条件。

1.2.3 数据处理和统计方法

采用SPSS 19.0软件的一般线性模型（GLM）进行单因素方差分析，用Duncan’s的极大复极差法（RRS）进行各组间比较，数据取平均值。

2 结果与分析

2.1 蜡样芽孢杆菌培养条件的优化

2.1.1 正交试验设计

通过对各因素的极差分析，可以看出各因素对试验指标的影响程度按顺序从大到小排列为F>A>E>G>B>C>D，即：酵母粉>葡萄糖>蛋白胨>硫酸铵>蔗糖>淀粉>牛肉粉。各因素选取水平为：A3B3C2D2E3F3G3，即葡萄糖1.5%、蔗糖1.5%、淀粉0.5%、牛肉粉0.5%、蛋白胨1.5%、酵母粉1%、硫酸铵0.5%（见表3）。

表3 L18（37)正交试验设计及结果分析

方差分析结果：F、A、B、E、G的P值分别为0.013、0.028、0.039、0.041、0.049，对试验影响显著，C、D 的P值分别为0.085、0.137，都大于0.05对试验影响不显著，显著性顺序为F>A>B>E>G>C>D（见表4）。

表4 L18（37)正交试验方差分析

2.1.2 最佳发酵时间

每2 h 取样测定蜡样芽孢杆菌的OD 值，结果如图1。由图1可以看出接种蜡样芽孢杆菌后，0～6 h菌数大量增长，这时的蜡样芽孢杆菌处于对数增长期，18～20 h 时蜡样芽孢杆菌处于生长的稳定期，从22 h开始，蜡样芽孢杆菌开始进入生长的衰亡期，因此，发酵的时间可定为18～20 h。

图1 蜡样芽孢杆菌发酵曲线

2.1.3 验证试验

按照葡萄糖1.5%、蔗糖1.5%、淀粉0.5%、牛肉粉0.5%、蛋白胨1.5%、酵母粉1%、硫酸铵0.5%，发酵8～20 h 进行液体发酵，所得蜡样芽孢杆菌液体发酵的活菌数为1.3×1012CFU/mL，优化前的活菌数为8×1011CFU/mL，优化后活菌数提高了62.5%。

2.2 嗜酸乳杆菌发酵条件的优化

2.2.1 优化试验结果

通过各因素的极差分析，可以看出各因素对试验指标的影响程度按顺序从大到小排列为：C>A>B，即：营养促进因子>N源>C源。营养促进因子（番茄汁）的R值高于其他因子，是影响嗜酸乳杆菌生长的主要因素，而因子葡萄糖的R值最低，说明葡萄糖对嗜酸乳杆菌菌液浓度的影响较小。发酵条件优化最优组合为A3B2C3，即大豆蛋白胨1%、葡萄糖2%、番茄汁20%（见表5）。

表5 L9（34）正交试验设计及结果分析

方差分析结果：A、B、C 的P值分别为0.031 1、0.060 5、0.010 4。A，C 的P值都小于0.05，对试验影响显著，显著性顺序为C>A>B（见表6）。方差分析的结果与极差的结果一致。

表6 L9（34）正交试验方差分析

2.2.2 最佳发酵时间

每2 h 取样测定产嗜酸乳杆菌的OD 值，结果如图2。由图2 可以看出接种后0～4 h 菌数的变化不明显，4～12 h 菌数大量增长，此时嗜酸乳杆菌处于对数增长期，22 h时达到最大，之后有下降趋势。因此，最佳发酵时间确定为22 h。

图2 嗜酸乳杆菌发酵曲线

2.2.3 验证试验

验证试验结果表明，按照大豆蛋白胨1%、葡萄糖2%、番茄汁20%，发酵22 h 进行液体发酵，所得嗜酸乳杆菌液体发酵的活菌数为1.9×1011CFU/mL，比优化前（1.3×1011CFU/mL）提高了46.15%。

3 讨论

益生菌制剂作为当前畜牧业养殖中替代抗生素的新型饲料添加剂，已广泛应用到畜禽养殖生产实践中。较为常见的益生菌主要包括乳酸杆菌、蜡样芽孢杆菌、产朊假丝酵母等菌种。王珍珊等[14]研究发现，添加4.0%嗜酸乳杆菌微胶囊制剂可以提高肉羊生长性能、屠宰性能及肉品质。王茜[15]研究发现嗜酸乳杆菌能提高肉鸡生长性能，促进肠道益生菌定植，降低饲养成本，提高经济价值。获得高产、高效的益生菌最关键的问题在于益生菌发酵条件的优化。本试验通过调整蜡样芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌液体培养基中各组分的比例，确定了最适合菌株的生长条件，使用优化的条件进行蜡样芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌的发酵，活菌数分别提高了62.5%和46.15%，从而有效降低生产成本，为蜡样芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌在动物生产中的广泛应用提供一定的依据。

4 结论

①蜡样芽孢杆菌最优生长条件为：葡萄糖1.5%、蔗糖1.5%、淀粉0.5%、牛肉粉0.5%、蛋白胨1.5%、酵母粉1%、硫酸铵0.5%（均为质量分数），最大活菌数可达到1.3×1012CFU/mL。

②嗜酸乳杆菌最优生长条件为：MRS 液体培养基中添加1%大豆蛋白胨、2%葡萄糖、20%营养促进因子（番茄汁）、发酵22 h，此时最大活菌数可达到1.9×1011CFU/mL。