高通量药物敏感性筛选系统在非小细胞肺癌伴恶性胸腔积液治疗中的应用

张 宇，吴晓渊，管丽华，刘译远，彭星月，谢海燕，胡 玮，郝可可，夏 宁，陆国军，侯志波

1.南京市胸科医院/南京医科大学附属脑科医院呼吸一科，南京 210029；2.南京市胸科医院/南京医科大学附属脑科医院中心实验室，南京 210029；3.南京市胸科医院/南京医科大学附属脑科医院信息科，南京 210029；4.南京融康博临床医学研究院，南京 210018

肺癌的发病率和死亡率均高居全球疾病的前列［1］，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是原发性肺癌的主要类型，约占85%［2］。肺癌伴恶性胸腔积液（malignant pleural effusion，MPE）首诊检出率约15%，疾病发展过程中至少有50%的患者会出现胸腔积液。胸腔积液一旦被确诊为恶性，则提示已是肿瘤晚期，对患者的生活质量及预后有极大的影响［3］。

虽然近年来分子靶向治疗、免疫治疗在对NSCLC 的治疗中取得了里程碑式的进展，但含铂双药仍然是驱动基因阴性晚期NSCLC 患者的一线标准治疗方案，有效率为30%～40%［4］。然而在相同的化学治疗（化疗）方案和相应的给药剂量下，不同个体对化疗的敏感性差异较大。如何挑选出化疗有效的患者，减少化疗的盲目性，特别对于三线后治疗无标准方案的肺癌患者制定出合理的个体化抗肿瘤治疗方案，是精准医疗时代亟待解决的课题。

本研究选择NSCLC 合并MPE 患者，获取胸腔积液中的肿瘤细胞培养原代细胞，通过使用自动数字荧光扫描仪的高通量药物敏感性筛选系统检测其对化疗药物和分子靶向药物的体外直接敏感性，评估经体外培养的肿瘤原代细胞的药物敏感试验结果与患者临床治疗疗效是否一致，为临床筛选化疗药物及制定抗肿瘤治疗方案提供试验性参考依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

纳入2019年1月—2020年5月于南京市胸科医院呼吸一科就诊的伴MPE 的NSCLC 患者，纳入标准：①胸腔积液经病理证实为恶性。②血常规，心、肝、肾等脏器功能基本正常。③卡氏评分≥70 分。④预计生存期超过3 个月。⑤初诊患者胸腔积液同时制备细胞蜡块行EGFR、ALK、ROS1检测。⑥经患者知情同意。排除标准：①胸腔积液肿瘤细胞数量≤1×106个的患者。②病例资料不完整者。本研究经南京市胸科医院伦理委员会批准（批件号：2018-KL008-01）。

1.2 材料与方法

本研究采用的Techboon D-Sense 法来源于瑞典卡罗林斯卡医学院Laszlo教授等研发的高通量药物敏感性分析系统，通过液体活检的方式对患者的癌细胞进行抗肿瘤药物敏感性体外检测［5-6］。该方法使用能够模拟人体内环境的Techboon 培养基培养肿瘤原代细胞，一次检测仅需6 d 就可获得30 种抗肿瘤药物的体外敏感性分析结果。

无菌收集NSCLC 合并MPE 患者的胸腔积液400 mL，800×g离心10 min，分离纯化肿瘤细胞后，经涂片染色鉴定及质控评估，合格方可进入药物敏感性试验流程。将预设的30种抗肿瘤药物（图1）溶解在二甲基亚砜中，每种药物以最大浓度按比例稀释为4 种浓度（稀释比例分别为1∶1、1∶5、1∶25 和1∶125），重复3 孔；未加药的细胞孔作为对照。使用Echo 525 液体声学处理器喷印在384 孔滴定板上。每孔加入含0.3×104～0.5×104个肿瘤原代细胞的培养液，置于37 ℃二氧化碳培养箱孵育6 d，用专有的D-染色液对活细胞和死细胞进行固定和差异染色。使用Techboon D-计数自动数字荧光成像仪分析药板，经自定义开发图像分析程序，使用5 种独立的成像算法识别和计数存活的肿瘤细胞，取3 次重复的中位数记录为试验结果。

杀伤效率是根据既往文献［5］发表的公式计算出的不同浓度下所有杀伤效率的加权总和。肿瘤细胞药物杀伤效率排序，浓度依赖性生存图，以及完全可缩放拼接的原始和处理过的平板图像，由定制开发的程序在Linux计算机上生成。

1.3 治疗方法

根据《中国临床肿瘤学会（CSCO）原发性肺癌诊疗指南（2019 版）》［7］，驱动基因阳性的患者采用靶向治疗，驱动基因阴性以及靶向治疗耐药后的患者采用含铂双药方案化疗（非鳞癌可联合抗血管生成治疗）。选择适合病例（如二/三线治疗后无标准治疗方案的患者或一/二线治疗无效的患者），按照药物敏感性结果并结合患者体力状况选择敏感药物给予治疗。

1.4 疗效评价

化疗2 个周期后进行疗效评价。通过实体瘤疗效评价标准判断疗效：①完全缓解（complete response，CR），所有目标病灶消失并维持4 周。②部分缓解（partial response，PR），基线病灶长径之和缩小≥30%并维持4 周。③疾病进展（progressive disease，PD），基线病灶长径之和增加≥20%或出现新病灶。④疾病稳定（stable disease，SD），基线病灶长径之和有缩小但未达PR，或者增加但未达PD。

如Techboon D-Sense 法检测结果显示药物低度至高度敏感，经临床治疗患者疗效评定为SD/PR/CR，则提示体外高通量药物敏感试验结果与患者临床治疗效果一致。如检测结果显示为药物耐药，经临床治疗患者疗效评定为SD/PR/CR，则提示体外高通量药物敏感试验结果与患者临床治疗效果不一致。

2 结果

共纳入符合条件的患者30 例，其中男性16 例，女性14 例，平均年龄64 岁；初治17 例，复治13 例；腺癌26例，鳞癌3例，腺鳞癌1例。

2.1 原代细胞的药物敏感性

研究采用Techboon D-Sense 法分析30 例NSCLC患者MPE中原代细胞的体外药物敏感性，每例样本采用30种不同的药物进行检测，在第6日计算每个孔中存活细胞的百分比。结果见图2。大部分原代细胞对表柔比星、洛铂、吉西他滨以及伊立替康敏感，杀伤效率为30%～45%；大部分原代细胞对阿来替尼、环磷酰胺和替莫唑胺具有抗药性，杀伤效率低于10%。

图2 30例NSCLC患者MPE原代细胞对30种抗肿瘤药物的药物效应值Fig 2 Killing efficiency of primary tumor cells cultured from 30 MPE patients with NSCLC for 30 different antitumor drugs

2.2 聚类分析热图

为了可视化30 种药物对所有患者样本的影响，我们将数据绘制为热图（图3）。杀伤效率低于10%为耐药，10%～30%为低度敏感（标为蓝色，蓝色的深浅与药物的耐药程度成正比）；杀伤效率30%～70%为中度敏感，高于70%定义为高度敏感（标为黄色，黄色的深浅与药物的敏感程度成正比）。不同原代肿瘤细胞分离株对药物的敏感性存在较大异质性。患者S2、S4、S11、S26 和S30 对药物较敏感，S1、S3、S12、S20 和S24 对药物具有耐药性。表柔比星、洛铂、吉西他滨和伊立替康是最有效的药物。

图3 30例NSCLC患者MPE原代细胞30种药物杀伤效率的热图分层聚类Fig 3 Heat map and hierarchical clustering analysis of the killing efficiency of 30 drugs in primary tumor cells cultured from 30 MPE patients with NSCLC

2.3 体外高通量药物敏感试验结果与患者临床治疗效果一致性分析

30例患者中，有23例接受化疗或分子靶向治疗，可以评价疗效，进行一致性分析（见表1）。①初治15 例。其中EGFR阳性患者9 例，接受了一代/二代EGFR-TKI治疗，PR 7例，SD 2例。靶向治疗的效果与体外高通量药物敏感试验结果一致4 例，不一致5 例，一致率为44.4%（4/9）。EGFR阴性患者6 例，5例接受培美曲塞+铂类化疗，1例腺鳞癌接受多西他赛联合奈达铂化疗；PR 2 例，SD 3 例，PD 1 例。与体外高通量药物敏感试验结果一致4例，不一致2例。②复治8 例。其中EGFR阳性患者5 例，接受了一代和/或三代EGFR-TKI 治疗后耐药，EGFR阴性患者3 例（鳞癌2 例）；8 例患者均接受化疗，PR 3 例，SD 4 例，PD 1 例，其疗效与体外高通量药物敏感试验结果一致。采用化疗的效果与体外高通量药物敏感试验结果一致率为85.7%（12/14）。

表1 23例可评价临床疗效NSCLC患者的临床特征以及体外高通量药物敏感试验结果与患者临床治疗效果一致性Tab 1 Clinical characteristics of 23 NSCLC patients with evaluable clinical efficacy and the consistency between the results of highthroughput drug sensitivity test in vitro and the clinical efficacy

Continued Tab

其中S21 是一位45 岁晚期肺腺癌男性患者，在一线吉非替尼、二线培美曲塞联合顺铂、三线奥希替尼治疗后再度疾病进展，出现MPE，胸腔积液NGS检测提示EGFR19DEL/20T790M/20C797S（顺式），自服布加替尼出现间质性肺炎，应用激素治疗得到缓解后根据高通量药物敏感性检测结果（吉西他滨高度敏感、洛铂中度敏感，见图4），采用吉西他滨联合洛铂化疗后疗效达PR，患者症状缓解，胸腔积液控制。本例表明即使分子检测结果提示靶向治疗无药可选，基于Techboon D-Sense 法检测结果选用化疗药物，仍然是晚期肺癌伴MPE 患者个体化治疗的可行选择。

图4 S21患者胸腔积液腺癌原代细胞在药物稀释作用下的浓度依赖性生存情况Fig 4 Concentration-dependent survival of primary pleural adenocarcinoma cells in S21 patient with drug dilution

3 讨论

肺癌的发病率和死亡率位居肿瘤总体发病率和死亡率的前列，且大部分肺癌患者就诊时已是晚期。尽管近年来靶向治疗和免疫治疗给部分晚期NSCLC 患者带来生存获益，但在肺癌患者的全程管理中，化疗仍是一线方案，必不可少［8］。

目前肺癌化疗方案的选择主要基于组织学类型，然而同种组织学类型的肺癌对相同化疗药物产生的反应却不尽相同。既往通过核苷酸切除修复交叉互补基因1、核苷酸还原酶1、乳腺癌易感基因1、β 微管蛋白、胸苷合成酶核苷酸等在内的化疗药物相关基因检测来预测化疗效果及其指导化疗的临床试验得到的都是阴性结果，不能用于指导临床实践［9-10］。众多基于体外试验，甚至临床前小鼠模型的药物敏感性预测的研究结果同样令人失望［11-15］。虽然肿瘤细胞系操作简单，试验要求低、周期短，但细胞系并不能实际反映原代肿瘤的生理状况，而且将细胞系原位种植在免疫缺陷小鼠上后，药敏试验并不能预测原位肿瘤的药物敏感性。患者来源的肿瘤模型忠实地再现了人类肿瘤生物学，并能预测潜在的临床反应，包括患者来源的肿瘤异种移植模型和患者来源的类器官等等，但这些技术在检测药物通量、周期、成本和准确率等方面的局限限制了临床的实际应用［16-19］。原代细胞最接近也更真实地反映体内生长特征，更能代表患者的生物学和临床特性，表现肿瘤的个体化特征并用于临床转化，其在体外条件下的研究需要特定的标准化的培养系统［20-21］。

本研究采用的Techboon D-Sense 法与肿瘤体外药敏试验方法相比在方法学上有其优点：①个体化。应用患者自身恶性细胞培养原代细胞，充分模拟液态下肿瘤细胞的体内生存环境，避免了细胞早期凋亡及细胞变异，保证肿瘤细胞的体外生存活力，使个体化药物敏感性检测分析成为可能。②标准化。使用Echo 525 液体声学处理器将药物喷印在348 孔滴定板上，实现准确移液，保证组内试验药物浓度的一致性和稳定性。在单细胞水平重复3 次的四步药物稀释系列测量药物诱导的细胞毒性，可重复性高。③高通量、高效性。临床采集400 mL 癌性胸腔积液，一次检测仅需6 d 就可获得30 种药物的敏感性分析结果，可以快速找到个体化的抗肿瘤药物治疗方案。④智能性。运用自定义开发的智能软件分析系统，采用5 种独立图像分析算法准确分析计算细胞数，自行定制开发程序在计算机上生成检测报告。该方法最大程度地减少了人为因素的影响，提高了试验效率，为开展临床样本检测提供了保障。

Techboon D-Sense 检测法适用于白血病、淋巴瘤、癌性浆膜腔积液等肿瘤细胞呈悬浮生长的标本。该方法已用于恶性血液病的药物敏感性检测［22-24］，包括建议将紫杉醇和放线菌素D 纳入晚期霍奇金淋巴瘤合并胸腔积液的化疗方案［22］。在慢性淋巴细胞白血病研究中发现，柔红霉素最有效（有效率97.4%）且与泼尼松龙具有较强的协同作用，建议将低剂量柔红霉素和泼尼松龙联合治疗作为慢性淋巴细胞白血病耐药病例的治疗选择［23］。该技术应用于分子生物学方面的研究发现蛋白磷酸酶1 抑制蛋白在控制关键蛋白的磷酸化状态、调控白血病细胞的药物敏感性和凋亡中起着重要的作用［24］，为临床诊疗提供新思路。

MPE 是研究体外和体内肿瘤发展的优质来源，它再现了肿瘤自然产生的异质性［25-27］。肿瘤异质性在药物耐药中的作用仍不清楚［28］。针对肺腺癌和恶性胸膜间皮瘤患者MPE 的Techboon D-Sense 法体外药物敏感谱分析表明，药物敏感性的个体差异很大。长春碱、长春瑞滨、紫杉醇和放线菌素D 对50%的肺腺癌原代细胞显示出较高的疗效，铂类药物和吉西他滨的体外敏感性与ERCC1 和RRM1 水平之间存在显著的相关性［6］。放线菌素D 和柔红霉素对于大多数恶性胸膜间皮瘤患者有效［5］。

王丹［29］收集12 例肺癌伴MPE 患者的胸腔积液培养肿瘤原代细胞，在高通量药物筛选平台进行药物敏感性检测，筛选出对肺癌细胞敏感的药物19 种，但并未与临床治疗效果相比较。

本研究表明，NSCLC 患者的MPE 可以用于研究肺癌的化疗敏感性，但与靶向药物疗效的一致性较低。分析其原因，靶向药物是针对细胞信号转导通路的，其临床疗效可能并不归因为它们的体外直接杀伤作用，因而杀伤效率较低。因此对于临床上存在EGFR突变的初治NSCLC 患者，仍应首选相应的靶向药物治疗。

以铂类为基础的化疗仍然是NSCLC 患者的标准治疗方案。我们基于MPE 原代细胞培养的高通量药物敏感性检测发现5 种铂类药物的抗肿瘤药物效应依次为：洛铂＞奈达铂＞奥沙利铂＞卡铂＞顺铂。在《中华医学会肺癌临床诊疗指南（2018 版）》［30］中，洛铂新增用于驱动基因阴性晚期NSCLC 的一线治疗。我们的研究提示在铂类药物的选择上无论是一线还是后线治疗，洛铂均可选择。总之，基于NSCLC 患者MPE 原代细胞培养的高通量药物敏感性检测与临床化疗效果的一致性较高，可以为临床筛选化疗药物及制定抗肿瘤治疗方案提供试验性参考依据，有助于制定个体化化疗方案，特别对于二/三线治疗后无标准方案的肺癌患者尤有意义。今后Techboon D-Sense 法的检测结果与临床疗效的相关性有待进一步扩大样本量及分层的临床验证。

致谢 感谢瑞典卡罗林斯卡学院微生物学、肿瘤和细胞生物学系Laszlo Szekely 教授和阿尔及利亚费尔哈特·阿巴斯塞提夫大学医学院药学系Nida El Islem Guissi在本研究中给予的试验支持。