基于定痫汤干预后癫痫小鼠海马区miRNA-204表达水平的变化及脑电图变化的研究

卢玲，刁丽梅，李欢，廖现秋

(1.广西中医药大学，广西 南宁 530001；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023)

癫痫是影响全球超过7000万人的最常见的慢性脑部疾病之一，它极大地影响了患者的生活质量，并且对患者的健康造成了严重的威胁[1-2]。目前的抗癫痫药物能够减轻患者的症状，但不能抑制致痫过程的发展，且长期使用也会引起各种不良反应，亦会使药物的敏感性降低[3]。故而，研发疗效高、安全性好且副作用小的药物以及新型治疗方法具有重要的临床意义。

癫痫的发病机制尚不明确，因此了解癫痫发病所涉及的生物过程是研发新治疗方法和药物的基础。有研究表明，微小核糖核酸(miRNAs)的异常表达与癫痫的发病机制密切相关[4]。miRNAs在中枢神经系统中广泛表达，它能够参与中枢神经系统的分化、发育和成熟，且能够密切调节突触的可塑性，从而调节癫痫的发作[5]。而自噬在多种神经退行性疾病中同样扮演着重要的角色，也跟癫痫的发生发展密不可分[6]。

近年来，中药在治疗癫痫方面表现出了独特的优势，它能够减少癫痫的并发症，降低抗癫痫药物的副作用，提高患者的依从性。定痫汤是一个历史悠久治疗癫痫的经典方剂，具有化痰熄风，开窍止痉的功效。目前众多临床研究表明，定痫汤能够较好地提高癫痫治疗的疗效，改善癫痫的发作[7-8]。此外，实验研究表明定痫汤通过调节抗炎、抗氧化、神经保护等，发挥抗癫痫功效，以降低癫痫大鼠的发作频率，延长发作的潜伏期，减少大鼠脑电图的痫性波形[9-10]。本课题组前期的基础研究发现定痫汤的抗癫痫机制可能与其对miRNAs的调控作用有关。因此，我们前期的基础研究对癫痫小鼠miRNAs进行了基因芯片检测，发现miRNA-204在癫痫小鼠的海马组织中表达下调[11]。因此，本实验研究定痫汤干预后，小鼠脑电图的变化，癫痫小鼠海马区miRNA-204表达的变化，及自噬相关蛋白(ATG7和LC3II)的表达变化，探究定痫汤治疗癫痫的可能疗效机制。

1 材料

1.1 主要实验仪器

视频脑电图仪NATION7128W(上海诺诚电气股份有限公司)；光学显微镜BX43(日本Nikon)；Ariamx型实时荧光定量PCR仪(安捷伦科技有限公司)；低温离心机(德国eppendorf公司)；VeritiTM96-Well Thermal Cycler(美国Applied Biosystems公司)；超微量核酸检测仪(杭州遂真生物技术有限公司)。

1.2 主要实验试剂

BSA(Servicebio 公司 G5001)；DAB 显色剂(Servicebio公司 G1211)；Anti-LC3II抗体(博奥森公司 bs-2912R)；Anti-ATG7抗体(博奥森公司 bs-2432R)；柠檬酸(PH 6.0)抗原修复液(Servicebio 公司 G1202)；PBS 缓冲液(Servicebio 公司 G0002)；正常兔血清(Servicebio 公司 G1209)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time) (Takara公司 RR047A)；TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(Takara公司 RR820A)。

1.3 实验动物

健康昆明小鼠，雄性，体质量20～22 g，周龄8～10周，由广西中医药大学实验动物中心提供(许可证号：SYXK桂2009-0001)。分笼饲养，每笼5只，室温22～23 ℃，12 h交替光照，给予SPF级饲料和饮用水。所有小鼠均需适应环境2周及以上方可进行实验操作。实验动物的饲养和操作均在SPF级环境中进行，且实验过程严格遵照广西中医药大学动物伦理委员会的各项规定。

1.4 主要实验药物

定痫汤组成：天麻12 g，茯神12 g，姜半夏9 g，胆南星9 g，川贝母12 g，茯苓12 g，石菖蒲9 g，僵蚕10 g，全蝎6 g，琥珀6 g，陈皮12 g，远志10 g，丹参15 g，麦冬15 g，朱砂0.5 g，甘草6 g，所有药材均由广西中医药大学第一附属医院药剂科统一采购备用，采用自动煎药机煎煮，浓缩至药物浓度500 mg/mL；盐酸匹罗卡品(Pilocarpine Hydrochloride,美国Sigma公司),硫酸阿托品注射液(郑州铃锐制药有限公司)。

2 实验方法

2.1 造模与分组

将40只健康雄性昆明小鼠按随机数字表法随机分为4组，分别为：模型组、生理盐水组、卡马西平组、定痫汤组。分别对各组动物进行灌胃2周，模型组和生理盐水组均予20 mL·kg-1·d-1生理盐水进行灌胃；定痫汤组予7 g·kg-1·d-1定痫汤药液进行灌胃；卡马西平组予30 mg·kg-1·d-1卡马西平混悬液灌胃。灌胃2周后，对模型组、卡马西平组、定痫汤组实验动物进行造模。造模时，先使用硫酸阿托品(17 mg/kg)进行腹腔注射；30 min后，再使用Pilocarpine Hydrochloride(180 mg/kg)进行腹腔注射；小鼠给药完毕后，按照经典的Racine(1972)的实验动物痫性发作标准对小鼠进行行为学观察[12]。若腹腔注射30 min后，小鼠未能出现Ⅳ级以上痫性发作的，则每隔15 min对小鼠进行追加腹腔注射，追加注射的Pilocarpine Hydrochloride剂量为：首剂量的1/3。若追加Pilocarpine Hydrochloride腹腔注射2次以后，小鼠仍未能出现Ⅳ级以上痫性发作的，则视其为造模失败，不再纳入下一步行为学观察及后续实验。若小鼠痫性发作持续时间达到1 h，则给予地西泮腹腔注射，以终止痫性发作。本实验的对照组生理盐水组小鼠给予注射等量的生理盐水。

2.2 脑电图检测

将各组小鼠分别进行固定制动，再将脑电图仪的针电极分别插入小鼠左右颞骨的表面,并与同侧耳电极连接，待固定平稳后监测并记录各组小鼠的脑电图。将纸速设定为：3 cm/s，将波形敏感度设定为：80 μV/cm。

2.3 荧光定量PCR检测miR204表达量

2.3.1 RNA提取及逆转录

各组小鼠海马组织分别剪成细小的碎片，取50～100 mg放入2 mL离心管置于冰盒上，加入1 mL TriQuick Reagent，用匀浆机匀浆至无沉淀。匀浆静置(室温)5 min，加入0.2 mL氯仿，震荡15 s，静置(室温)2 min；4 ℃离心，12 000 r/min离心15 min，取上清0.5 mL加入洁净的1.5 mL离心管；加入0.5 mL异丙醇，混匀，静置(室温)10 min；4 ℃，12 000 r/min离心10 min，弃上清；先后加入两次1 mL的75%乙醇，依次进行洗涤沉淀，4 ℃，12 000 r/min离心5 min，弃上清；再加入1 mL无水乙醇，重复上述操作；随后置于65 ℃金属浴锅上烘干沉淀，加0.03 mL DEPC水溶解。使用超微量核酸检测仪进行RNA浓度及纯度检测后进行逆转录操作，所得cDNA置于-80 ℃保存待用。

2.3.2 qPCR检测

qPCR反应体系为：TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ:10 μL，cDNA：1 μL，Primer Forward(10 μmol/L)：0.4 μL，Primer Reverse(10 μmol/L)：0.4 μL，H2O：8.2 μL；反应程序：预变性95 ℃ 30 s,PCR循环(40循环)：95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s;溶解曲线：标准溶解曲线程序。引物序列如表1所示。

表1 引物序列

2.4 免疫组化检测自噬相关蛋白ATG7、LC3 II表达情况

使用甲醛对小鼠脑组织进行固定，通过石蜡进行包埋。然后将小鼠脑组织以3～5 μm为厚度进行冠状切片。组织切片经烘烤(60 ℃恒温箱)30 min后，再置于二甲苯中进行浸泡，浸泡时间为15 min；更换二甲苯后再次浸泡15 min；再将切片依次置于二甲苯∶乙醇=1∶1混合液、无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、蒸馏水中分别浸泡10 min；随后用蒸馏水室温封闭10 min；然后进行抗原修复，修复过程为：将组织切片置于盛满使用柠檬酸(pH 6.0)抗原修复液的修复盒中于微波炉内，先中火加热8 min至煮沸，然后停火静置8 min，保温再转中低火维持7 min；修复完成后对内源性过氧化物酶进行阻断；随后进行血清封闭；加入一抗孵育过夜；回收一抗，TBS 洗2遍，每次5 min；加入二抗，室温孵育50 min；TBS 洗4遍，每次5 min；加入DAB进行显色；用苏木精复染细胞核；再依次将切片置于蒸馏水、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、二甲苯∶乙醇=1∶1混合液、二甲苯中浸泡5 min，随后更换二甲苯再次浸泡5 min，进行脱水封片；晾干、观察结果。

2.5 统计学分析

3 结果

3.1 各组小鼠行为学表现

对各组小鼠分别进行行为学观察，观察结果显示,生理盐水组在观察过程中未出现任何痫性发作症状；模型组小鼠造模成功后，主要表现为弓背、二便失禁、后腿直立、前脚阵挛、尾巴竖起等，且模型组小鼠癫痫发作频率及持续时间均最长；卡马西平组和定痫汤组痫性发作的频率较模型组减少，且发作持续时间较模型组明显缩短。结果表明,定痫汤和卡马西平对小鼠癫痫发作具有抑制作用。

3.2 各组小鼠脑电图分析

脑电图结果显示，生理盐水组小鼠脑电图表现为正常波形；而在模型组中可见较多的棘波、尖波和棘慢波频繁发放；在卡马西平治疗组中，仍可见少量尖波、棘波；在定痫汤治疗组中，也可见少量尖波、棘波发放，见图1。结果表明，定痫汤、卡马西平治疗后，癫痫小鼠的脑电图棘波、尖波、棘慢复合波可显著减少。定痫汤可抑制癫痫小鼠的痫性放电。

图1 各组小鼠脑电图情况

3.3 定痫汤对癫痫小鼠海马区miRNA-204的表达水平的影响

模型组的miRNA-204表达水平较生理盐水组下调，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，定痫汤组和卡马西平组miRNA-204表达上调(P<0.01)；定痫汤组与卡马西平组相比较，小鼠海马区miRNA-204的表达差异无统计学意义，见图2。实时荧光定量PCR的结果表明,定痫汤干预后癫痫小鼠海马组织miRNA-204的表达较模型组上调。

注：与生理盐水组相比，##P<0.01；与模型组相比，**P<0.01。图2 各组小鼠海马中miRNA-204的表达水平

3.4 各组自噬相关蛋白ATG7、LC3II在小鼠海马组织中表达情况比较

本实验免疫组化结果表明：ATG7和LC3 II这两个自噬相关蛋白在模型组小鼠海马组织中高表达，两者阳性细胞比例均高于生理盐水组(P<0.01)；定痫汤组、卡马西平组的小鼠海马组织中ATG7、LC3II蛋白表达下调，两组阳性细胞比例较模型组明显降低(P<0.01)。见表2。

表2 自噬相关蛋白在各组小鼠海马组织中的阳性细胞数比例

4 讨论

癫痫作为神经系统的常见疾病之一，反复发作导致患者日常工作和生活受到影响，长期的癫痫发作亦会使患者出现认知功能障碍、抑郁和焦虑等，给患者和社会带来了巨大的经济负担[13]。定痫汤由天麻、姜半夏、石菖蒲、全蝎、远志等16味药物组成，它与抗癫痫药物联合使用能够明显减少脑电图的痫性波、减少药物的不良反应、改善患者的症状、减少癫痫发作的频率，同时能够极大提高患者的依从性，常用于癫痫的临床治疗。既往的临床研究也进一步证实了定痫汤在癫痫治疗中的疗效[7]。此外，近年来的基础研究也表明，定痫丸可能通过抑制海马神经元细胞的凋亡，达到抗癫痫作用[14]。该中药复方中的天麻可能通过调节神经元细胞的电生理稳态、调节神经递质的平衡发挥抗癫痫作用[15]。半夏的抗癫痫机制可能与其增加大鼠海马γ-氨基丁酸的含量，提高γ-氨基丁酸的功能密切相关[16]。石菖蒲挥发油能够抑制神经细胞的凋亡，是一种长效的、抗癫痫谱广的抗癫痫药物[17]。全蝎的提取物具有良好的抗惊厥、抗癫痫和镇静作用，能够有效地减少小鼠癫痫发作的频率，延长惊厥的潜伏期[18]。而远志总皂苷能够改善癫痫继发的认知功能障碍，其可能的机制是远志总皂苷能够提高癫痫大鼠海马区烟碱型乙酰胆碱受体ɑ7亚基的表达[19]。为明确定痫汤的疗效，本实验使用定痫汤干预癫痫小鼠，并且对小鼠进行行为学和脑电图观察。结果表明，定痫汤能够明显缩短小鼠癫痫发作的持续时间、减少小鼠脑电图的棘波、尖波等痫性波的发放。

miRNAs是一种内源性短非编码核糖核酸。其在血液、组织和尿液中都具有稳定性，是疾病诊断的潜在生物标志物。研究发现，miRNAs可以调节胆碱能平衡、海马神经元的增殖和丢失以及神经炎症，在癫痫的发生和发展中起着关键的作用[13,20]。miRNA-204在癫痫患者海马区中表达下调，它能够抑制海马神经元中的癫痫样放电，是癫痫治疗的潜在靶点[21]。本课题组前期的基因芯片检测发现，miRNA-204在癫痫小鼠海马组织中表达下调。加味柴胡疏肝汤可能通过上调miRNA-204，保护海马神经元，抑制小鼠海马神经元的过度自噬，从而发挥抗癫痫作用[22]。本实验通过实时荧光定量PCR技术进一步证实了miRNA-204在癫痫小鼠中表达下调(P<0.01)，采用定痫汤干预后癫痫小鼠海马组织miRNA-204表达上调(P<0.01)。因此，定痫汤可能通过上调miRNA-204发挥抗癫痫作用。

自噬是一种在细胞中发挥作用的分解代谢过程，异常的自噬会对细胞分解代谢产生影响，从而导致细胞损伤。自噬存在于各种神经系统疾病中，在神经元损伤中起着关键作用，与癫痫的发生发展密切相关[23]。LC3 II是一种自噬相关蛋白，已经证实其在癫痫小鼠中表达上调并导致神经元的损伤[24]。ATG7是自噬体形成所必须的蛋白酶，它也是自噬的重要标志蛋白之一[25]。本课题组既往研究表明，上调miRNA-204可以抑制ATG7和LC3 II的过度表达，从而抑制自噬的发生，起到干预癫痫的发生发展的作用[22]。本实验通过免疫组化技术，进一步发掘了定痫汤对自噬的干预作用。在癫痫小鼠海马中，自噬相关蛋白ATG7和LC3 II的表达上调(P<0.01)；而定痫汤能够下调ATG7和LC3 II的表达(P<0.01)，从而达到治疗癫痫的目的。

总而言之，miRNA-204调控自噬相关蛋白ATG7和LC3 II的表达，导致海马神经元损伤，诱发自噬是癫痫发生发展的可能机制之一。定痫汤能够减短癫痫发作的持续时间、改善癫痫小鼠脑电图的癫痫样波形，其可能是通过上调miRNA-204的表达，抑制ATG7和LC3II的过度表达，抑制小鼠海马神经元自噬，发挥治疗癫痫的疗效。