肺不藏魄型失眠模型大鼠相关脏器多巴胺D1、D2受体表达差异研究

佟振鹏，张星平，3*，闫德祺，王凯凯，么嵌巍，梁政亭

(1.新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830017；2.新疆医科大学附属中医医院，新疆 乌鲁木齐 830099；3.新疆名医名方与特色方剂学重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830017)

中医在治疗失眠方面积累了丰富的临床经验，文献报道不论经方、自拟方或其他传统疗法，总有效率都在80%以上，显示出良好的临床疗效，且很好地弥补了现代医学的不足[1]。但因医家切入角度不同，对失眠辨证方法各异，如施今墨根据临床常见症状，以病因而论将失眠分为10种证型[2]；林佳通过整理筛选《中华医典》中确诊为不寐的条目，发现至少有39个证型[3]。如此繁多的分型，使后学者掌握和重现良好疗效较为困难。因此，探求一种实用客观的中医不寐分型方法显得尤为必要。

我们团队在“五神脏”理论及诸多医家相关理论指导下，发现失眠症状虽然繁杂，但仔细分辨无非是以下5类：①睡眠轻浅易寤；②入寐维艰、难以入睡；③梦多、多梦；④思虑纷纭而影响睡眠；⑤夜寐早寤、睡眠早醒。而且发现仅依据这5类单一症状即可以明确对应肺、心、肝、脾、肾五脏定位诊断，我们将之称为中医不寐五神分型诊断法[4-5]。

在前期研究中，我们团队完成了中医不寐五神分型多导睡眠图(Polysomnography,PSG)特征的研究，纳入515例研究对象，其中肺不藏魄组94例，发现与正常组比较,肺不藏魄组的非快速动眼睡眠(non-rapid eye movement,NREM)N1期显著高于正常组,其N2期与正常组无显著性差异,N3期、快速动眼睡眠期(ra-pid eye movement,REM)显著低于正常组[6]。这一特征作为以下肺不藏魄型失眠大鼠模型的评价标准。

多巴胺(Dopamine,DA)是一种重要的内源性儿茶酚胺类物质，目前研究认为DA在觉醒状态中起着极其重要的作用[7-10]。多巴胺受体为七个跨膜区域(7-GM)组成的G蛋白偶联受体家族，分有5个亚型，其中D1和D5亚型为D1样受体，其作用机制主要通过升高细胞内的环磷酸腺苷(cAMP)作为第二信使通过激活PKA(cAMP依赖性蛋白激酶)，使靶细胞蛋白磷酸化，从而调节参与睡眠-觉醒过程。D2、D3和D4亚型为D2样受体，通过降低细胞内的cAMP在维持觉醒中发挥重要作用[11-12]。故选取多巴胺D1和D2受体进行肺不藏魄型失眠的研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂及仪器

山羊抗兔多巴胺D1、D2多克隆抗体、免疫组化染色试剂盒(SP-0023，北京博奥森生物技术有限公司)；苏木素伊红染色液(北京雷根生物技术有限公司)；中性树胶(北京博奥森生物技术有限公司)；DZF-6090真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；DM2500生物显微镜；Q550图像处理系统(德国徕卡公司)；轮转式石蜡切片机等。

1.1.2 实验动物

采用鼠龄13～14周龄、体质量(200±30)g的雄性SD大鼠16只，由新疆医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK(新)2016-0003。实验前适应性喂养3 d,自由摄食饮水、室温(23±1)℃、相对湿度保持为30%～40%。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组

16只SD大鼠依据随机数字表法分为对照组、失眠模型组，每组8只。

1.2.2 肺不藏魄型大鼠失眠模型建立

以小平台水环境法(small platform water environment)[13]建立肺不藏魄型大鼠失眠模型，用有机玻璃制作30 cm×30 cm×35 cm的睡眠剥夺箱，其内有一直径为4.5 cm，高8.0 cm的平台，水深2 cm，水温(26±2)℃，以减少水温变化对大鼠造成的环境应激。将睡眠剥夺组大鼠置于其中，在平台上方8 cm处是食物以及饮用水槽，大鼠可自行摄食饮水，活动空间内采用40 W的日光灯于08∶00—20∶00照射来模拟昼夜，室内温度维持在(23±1)℃，室内相对湿度保持为30%～40%，剥夺箱上方有不锈钢网罩。应用此法大鼠尚能进行NREM期睡眠，剥夺的主要是REM期睡眠，大鼠模型病理特征为缺乏REM期睡眠，也即睡眠表浅，这与我们前期研究中肺不藏魄型失眠患者的临床表征睡眠轻浅易寤及PSG表现特征缺乏REM期睡眠基本吻合[4,6]，所以该原理大鼠动物模型可以作为中医肺不藏魄型失眠动物模型。

对照组笼中饲养，不做任何干预处理，室温、相对湿度、灯光与以上各组相同。

1.2.3 HE染色

使用苏木素伊红染色液对切片进行HE染色，石蜡切片经2次二甲苯脱蜡，6次梯度酒精复水，蒸馏水冲洗，苏木素液染核10～15 min，自来水冲洗片刻，1%盐酸酒精分化3 s，立即流水冲洗，稀氨水溶液反蓝1 min，流水冲洗，0.5%伊红水溶液复染2～5 min，再次冲洗，通过6次梯度酒精脱水，2次二甲苯透明，中性树胶封片。

1.2.4 免疫组化染色

石蜡切片经3次二甲苯，6次梯度酒精，蒸馏水冲洗，抗原修复液微波炉中修复，3%双氧水孵育、山羊血清工作液封闭，滴加一抗孵育、二抗孵育、滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液孵育，DAB显色镜下观察终止反应，苏木素染核、氨水返蓝，再经梯度酒精二甲苯脱水，中性树胶封片。

1.3 观察指标

1.3.1 HE染色肺组织及脑组织病理形态

镜下观察肺组织中肺泡、肺间质、肺毛细血管及脑组织中大脑皮层、海马、下丘脑的病理形态变化并采集图像。

1.3.2 免疫组化中各脏器多巴胺D1、D2受体表达水平

镜下观察每只大鼠肺、大肠、脑、心、肝、脾及肾组织，各组织均观察5张切片，每张切片各取3个视野，应用image pro plus 6.0软件计算平均光密度值(IOD/area)。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 肺及脑的病理变化

失眠模型组在光镜下见肺组织中肺泡壁毛细血管轻微扩张充血、纤维结缔组织增生致使肺泡壁增厚、肺泡腔可见巨噬细胞，对照组肺组织光镜下结果基本正常(图1)。失眠模型组、对照组大鼠脑组织无血管扩张充血，血管周围间隙未见增宽，无水肿，未见淋巴细胞、单核细胞浸润。各脑区形态结构未见明显异常(图2)。

注：A.对照组；B.失眠模型组。图1 两组大鼠肺组织HE染色(200×)

注：A.对照组；B.失眠模型组。图2 两组大鼠海马区HE染色(200×)

2.2 各脏器中D1、D2受体的表达

用SP法染出的免疫组织化学阳性反应产物呈黄褐色，失眠模型组大鼠可见D1受体大量分布于大脑皮层、海马、下丘脑等处。皮层内多巴胺受体D1阳性产物的分布最为密集；海马内可见多巴胺受体D1阳性产物清晰地分布在胞体和树突上。而D2受体主要分布于海马结构及颞叶内侧脑区。对照组多巴胺受体D1、D2阳性产物亦在皮层、海马、纹状体、苍白球等部位见到分布。

在失眠模型组及对照组的肺中D1受体及D2受体均主要分布在呼吸道黏膜上皮及肺泡表面；心肌组织上主要是巴胺受体D1亚型，还存在少量D2亚型；结肠组织中结肠黏膜层、黏膜下层均有D1、D2受体分布，且主要以D2受体为主；在对照组肾脏中D2受体分布在肾小球及肾动脉周围中；在两组脾脏中均见D1及D2受体分布；肝脏中未见明显D1、D2阳性反应物，见图3。

图3 各脏器中多巴胺D1、D2受体的分布(免疫组化染色，200×)

利用image pro plus 6.0软件进行图片分析得到IOD/Area数值，发现肺、脑、大肠、心中失眠模型组D1受体分布明显高于对照组，具有统计学差异(P<0.05)；失眠模型组D2受体分布明显低于对照组，具有统计学差异(P<0.05)；在脾脏、肝脏、肾脏中的分布数量差异无统计学意义(P>0.05)，见表1、2。

表1 各脏器中多巴胺D1受体表达(IOD/Area)情况

表2 各脏器中多巴胺D2受体表达(IOD/Area)情况

3 讨论

中医的核心是五脏，而五脏藏五神，五神又是一个整体，并由心神统领，主管睡眠等精神活动。脑虽为元神之府，但隶属于五脏，其生理病理与五脏密切相关。另中医学认为肺与大肠相表里，经脉相互络属，相互影响。故此次研究肺不藏魄型失眠选用大鼠肝、心、脾、肺、肾、脑与大肠来研究多巴胺D1、D2受体在其中的表达。

本实验检测D1、D2受体分布差异，发现与对照组比较，失眠模型组脑组织中，D1受体表达明显升高，D2受体表达明显降低。D1受体参与多种信号传导，包括Cs/cAMP/PKA通路，Golf/AC/PKA通路，Gq/PLC通路和电压门控钙离子通道，通过调节以上通路，D1受体升高导致觉醒状态增多[14-15]。D2受体则抑制大脑皮层乙酰胆碱释放，伏隔核多巴胺通过投射到基底前脑的GABA能神经，控制胆碱能神经元的兴奋性[16-18]。D1、D2受体含量的变化导致了觉醒状态的增多，进而导致失眠，说明肺不藏魄型失眠模型大鼠脑组织中D1受体表达明显升高，D2受体表达明显降低，这不仅是肺不藏魄型失眠模型大鼠脑组织中特征性神经递质分布差异之一，而且也是肺不藏魄型失眠模型大鼠失眠的可能机制之一。

与对照组比较，肺不藏魄型失眠模型大鼠肺与大肠组织中D1受体表达明显升高，D2受体表达明显降低，HE染色观察肺组织中肺泡壁毛细血管轻微扩张充血、纤维结缔组织增生致使肺泡壁增厚、肺泡腔可见巨噬细胞，说明以上结果可能是肺不藏魄型失眠模型大鼠的特征性神经递质分布差异及病理因素之一，其具体机制尚待进一步探讨。中医学理论认为肺为魄之宅，肺之精气充盈，则肺魄得以安养，魄神藏于其舍而寐安，反之若有邪扰肺络，肺之阴、阳、气、血亏虚，或邪实壅肺等原因导致肺失宣肃，肺主魄功能失常而不得卧[19-20]，正如《灵枢·淫邪发梦》曰：“魂魄飞扬，使人卧不得安而喜梦”。同时肺与大肠相表里，肺感病邪，宣发肃降失常，进而会影响大肠功能。

与对照组比较，肺不藏魄型失眠模型大鼠心脏组织中，多巴胺D1受体表达明显升高，D2受体表达明显降低，说明以上结果可能是该型失眠模型大鼠的特征性神经递质分布差异之一，其具体的作用和调控机制尚待进一步研究和阐明。心为五脏六腑之大主，主神志，在精神活动中占有主导地位，睡眠是在心神的主导下，由五脏协作共同完成的。《素问·灵兰秘典论》曰：“心者，君主之官，神明出焉；肺者，相辅之官，治节出焉。”肺与心同居上焦，生理功能密切相关，肺对心主神明司睡眠也起到重要作用。肺朝百脉、主治节，助心行血。心血得畅，心有所养，则神志安定。若邪扰肺脏，心血阻滞，心失所养，则发失眠[21]。

总之，本实验发现了肺不藏魄型失眠模型大鼠肺、大肠、脑、心脏组织中多巴胺D1受体表达明显增加，D2受体表达明显降低，说明D1受体表达增加，D2受体表达降低与肺不藏魄型失眠机制密切相关，是该型失眠模型的失眠机制之一，也是肺不藏魄型失眠模型大鼠的特征性神经递质分布差异之一，本研究丰富和充实了中医不寐五神分型法的理论和基础，为临床及科研服务。