生与炒酸枣仁配伍对状态性焦虑模型大鼠行为学及单胺类和氨基酸类神经递质表达的影响

张丽娟，郭文成，王艳艳，于爽，黄莉莉，李廷利

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

焦虑情绪是身心处于压力、危险、不熟悉情况下产生的对预期事件不安和担忧的体验。现代研究认为，焦虑主要与前额叶皮层、海马、杏仁核(包括外侧杏仁核与中央杏仁核)等结构有关[1]。焦虑症的发病机制尚不明确，在生化病理机制方面有多个假说，神经递质假说是目前认可度比较广泛的关于焦虑-抑郁发病机制的学说，该学说认为神经细胞末梢释放的多种物质在体内失衡从而引起了焦虑与抑郁等相关情绪。相关神经递质主要有NE、DA、5-HT、Glu、GABA等[2-7]。酸枣仁始载于《本经》，具有养血宁神安五脏的功效，是用来治疗失眠的要药。主要用于治疗虚烦不眠，惊悸多梦，体虚多汗，津伤口渴等症[8]。现代研究表明，生酸枣仁和炒酸枣仁都有镇静安神作用，临床常以生、炒各半组成药对应用，其主治病症主要与焦虑、抑郁等情志紊乱导致失眠等疾病有关，且疗效显著。但其治疗焦虑的作用机制尚不清楚。本实验主要以海马、LA为载体，以单胺类及氨基酸类神经递质的含量变化为切入点，旨在为进一步研究生与炒酸枣仁配伍对状态性焦虑的作用及其机制。

1 材料

1.1 实验动物

SD大鼠，雄性，体质量(240±10)g，SPF级，购买于辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SCKK(辽)2020-0001。实验动物饲养于标准的通气笼内；实验室实行12 h明暗交替；相对湿度为(50±10)%，温度(24±2)℃，并自由摄取食物和水，声音在40 dB以下。

1.2 实验药物及试剂

酸枣仁：产地山西，由黑龙江中医药大学王振月教授鉴定。阳性对照药：地西泮片，2.5 mg/片，山东信谊制药有限公司，批号：191006。林格氏液(Labcoms，批号：LA20200915)、OPA(Sigma-Alorich公司，批号：1002189920)、β-巯基乙醇(美国ACS恩科化学，批号：C10876872)、四硼酸钠(Sigma-Alorich公司，批号：74884-5Q)、硼酸(Sigma-Alorich公司，批号：C10806893)、Glu(批号：KFZA-8UP，纯度：94.3%)、GABA(批号：F29H-EQSB，纯度：99.8%)、5-羟色胺盐酸盐(批号：111656-200401，纯度：99.8%)、盐酸多巴胺(批号：F29H-EQSB，纯度：99.8%)和酒石酸去甲肾上腺素(批号：KFZA-8UP，纯度：94.3%)均购于中国食品药品检定研究院。

1.3 仪器

XR-XC404-2条件性恐惧实验监测系统，上海欣软信息科技；SuperFcs条件性恐惧实验分析系统，上海欣软信息科技；DW-2000大鼠脑立体定位仪，成都泰盟；CMA 402微量注射泵，瑞典CMA；CMA 12 Elite微透析探针，瑞典CMA； Clarity高效液相工作站，捷克DataApex；S1130高效液相泵系统，德国Sykam；AntecSDC电化学检测器，荷兰安泰克；高效液相工作站，美国Agilent；1260高效液相泵系统，美国Agilent。

2 方法

2.1 炒酸枣仁及OPA衍生剂的制备

炒酸枣仁的制备：取生酸枣仁，置炒锅内大火炒制3 min，炒后放凉，用时将炒制过的酸枣仁打成粗粉。炒酸枣仁及生炒配伍冻干粉的制备：取炒酸枣仁粗粉及生炒配伍(1∶1)粗粉230 g，各加入1.6 L蒸馏水，浸泡1 h，大火加热至沸腾后，改用小火煎煮30 min，煮至1.2 L。依次用8层、16层纱布过滤药液，滤液用旋转蒸发仪浓缩至200 mL，经冻干后得到其冻干粉。

OPA衍生剂的配置：精密称量OPA 25 mg，用0.6 mL甲醇溶解，加入0.05 mL β-巯基乙醇和5 mL 0.2 mol·L-1四硼酸钠-NaOH缓冲液(pH为9.2)，振摇、超声使之充分溶解，经0.2 μm滤膜过滤后避光4 ℃保存。

2.2 实验动物分组及给药

SD大鼠随机分为空白对照组、模型组、生与炒酸枣仁配伍组、炒酸枣仁对照组、地西泮对照组，每组6只。各给药组分别按20 g·kg-1给予炒酸枣仁、生与炒酸枣仁配伍的混悬液，地西泮对照组按3.6 mg·kg-1给予地西泮混悬液，空白对照组和模型组给予同体积溶剂。于大鼠条件性恐惧模型复制实验后，经灌胃途径连续给药10 d，每日早8∶00经灌胃给药1次。

2.3 大鼠状态性焦虑模型的复制及行为学评价

提前将各组实验大鼠移入实验环境中适应30 min。适应结束后，将各组大鼠置于条件性恐惧实验系统适应180 s，实验开始第1 min的前55 s内实验系统内部不加入任何信号干预；从第56秒开始，由扬声器持续发出声音信号(75 dB,1 000 Hz,5 s)，在声音信号持续的最后1 s内加以电刺激(0.5 mA,1 s)，上述操作每分钟循环1次，共计循环15次，连续4 d进行大鼠状态性焦虑的复制。空白对照组大鼠置于条件性恐惧实验系统内，只有声音信号而无电刺激。末次给药后将大鼠转移至EPM实验环境中适应1 h，适应期结束后，将大鼠头朝向一侧开放臂，放置在EPM的中央区域，让大鼠自由探索5 min。观察指标：大鼠进入开放臂次数及停留时间、闭合臂次数及停留时间，通过视频分析系统记录数据。

2.4 套管植入及取样

待大鼠充分麻醉后固定在脑立体定位仪上，充分暴露颅骨表面，确定植入实验动物LA脑区微透析专用套管的下末端坐标点(Ap=-3.5 mm，ML=-5.2 mm，DV=-5.5 mm)及海马脑区坐标点(Ap=-3.3 mm，ML=+2.0 mm，DV=-2.1 mm)，以颅骨钻刺穿颅骨；脑立体定位仪将套管缓慢植入到指定深度后固定套管。术后实验动物单笼饲养并恢复3 d。此后进行大鼠在体微透析取样实验。在大鼠清醒状态下插入探针后，以0.8 μL·min-1的速度开始透析，每2 h内收集的脑脊液为一个透析样品。每只实验动物持续收集24 h，得到12个透析样品后停止收集。保存于-80 ℃冰箱，待检测。

2.5 色谱条件

HPLC-ECD色谱条件：色谱柱Sykam C18(3 μm，2.1 mm×100 mm)，流动相为Na2HPO4·H2O：13.8 g·L-1；辛烷磺酸钠：160 mg·L-1；EDTA·H2O：10 mg·L-1；甲醇：100 ml·L-1；KCl：149.2 mg·L-1。流动相流速0.2 mL·min-1。工作电极电压：0.52 V。柱温：40 ℃。工作电极：玻璃碳电极。参比电极：银电极。进样量：20 μL。分析时间：25 min。

HPLC-OPA色谱条件：色谱柱Waters C18(5 μm,4.6 mm×200 mm)，流动相A相为水∶甲醇∶四氢呋喃，760∶180.5∶9.5；B相为水∶甲醇，240∶760。流动相流速0.8 mL·min-1。检测波长：338 nm。柱温：35 ℃。进样量：40 μL。分析时间：25 min。梯度洗脱程序，0～10 min，100%～47% A；10～14 min，47% A；14～14.01 min，47%～0% A；14.01～19 min，0% A；19～20 min，0%～100% A；20～25 min，100% A。自动进样程序：①从瓶A吸取40 μL；②从瓶B吸取OPA衍生剂60 μL；③将100 μL混合到针座中，10次，等待1 min；④进样。

2.5 方法学考察

2.5.1 标准曲线和线性范围

称取DA、NE、5-HT标准品各10 mg，定容至10 mL容量瓶中。移取混合标准品母液，用0.1 mol·L-1的HClO4溶液稀释得到浓度为50、25、12.5、6.25和3.125 pg·mL-1的标准品溶液。按2.4项色谱条件进行测定，以各目标物的色谱峰面积(Y)对其浓度(X,pg·mL-1)进行线性回归分析，得到标准曲线及相关系数。

分别称取Glu、GABA标准品各10 mg，放入1 mL容量瓶中定容，作为混合标准品母液。移取混合标准品母液，用超纯水倍比稀释得到浓度为12.8、3.2、0.8、0.2和0.05 μg·mL-1的标准品溶液。按2.4项色谱条件进行测定，以各目标物的色谱峰面积(Y)对其浓度(X,μg·mL-1)进行线性回归分析，得到标准曲线及相关系数。

2.5.2 精密度及加标回收率

取浓度为3.125 pg·mL-1的DA、NE、5-HT标品混合液，每次进样20 μL，每天进样5针，连续进样5 d，考察日内及日间精密度。取3组已知含量的生物样品，每个样品取10 μL并加入10 μL浓度为12.5 pg·mL-1的标准品，进样检测含量，利用公式计算出加样回收率。

取浓度为3.2 μg·mL-1的Glu、GABA标品混合液，每次进样40 μL，每天进样5针，连续进样5 d,考察日内及日间精密度。取3组已知含量的生物样品，每个样品取20 μL并加入20 μL浓度为3.2 μg·mL-1的标准品，进样检测含量，利用公式计算出加样回收率。

2.5.3 微透析探针的体外回收率

精密称取5-HT、DA、NE各10 mg置入1 mL容量瓶中，用0.1 mol·L-1的HClO4溶液定容，混合均匀，得到混合标准品母液。分别称取Glu、GABA标准品各10 mg，放入1 mL容量瓶中定容，作为混合标准品母液。将探针放入混合标准品中，连接微量进样泵，以林格氏溶液作为灌注液0.8 μL·min-1进行灌注，收集2 h内所有样品，测得体外探针的回收率，以此折算脑内神经递质的真实含量水平。

2.6 统计方法

3 结果

3.1 生与炒酸枣仁配伍拮抗大鼠状态性焦虑作用的结果及探针体外回收率

与空白对照组相比，模型组大鼠OT%、OE%均减少(P<0.05，P<0.01)；与模型组相比，炒酸枣仁对照组大鼠OT%、OE%均增加(P<0.05，P<0.01)，生与炒酸枣仁配伍组大鼠OT%、OE%均增加(P<0.05，P<0.01)，地西泮对照组大鼠OT%、OE%均增加(P<0.05，P<0.01)；与地西泮对照组相比，生与炒酸枣仁给药组大鼠OT%、OE%均增加(P<0.05，P<0.01)；与炒酸枣仁对照组相比，生与炒酸枣仁给药组大鼠在EPM中OT%、OE%均增加(P<0.05，P<0.01)，结果见表1、表2。

表1 探针体外回收率(%)

表2 生与炒酸枣仁配伍拮抗大鼠状态性焦虑作用的行为学比较

3.2 方法学考察结果

3.2.1 标准曲线和线性范围

各成分在相应浓度范围内线性关系良好，符合方法学要求，结果见表3。

表3 单胺类与氨基酸类神经递质的线性回归方程(n=5)

3.2.2 精密度及加标回收率

日内、日间精密度2.2%～3.2%。实验结果表明,各目标物的测定结果符合方法学要求，结果见表4。

表4 日内、日间精密度及回收率试验

3.3 LA脑区透析样品中NE、DA、5-HT、Glu、GABA含量测定结果及5-HT/NE、Glu/GABA水平变化

在LA脑区中，DA、NE、5-HT、Glu、GABA含量，5-HT/NE、Glu/GABA数值变化如下：与空白对照组相比，模型组DA、NE、5-HT、Glu、GABA含量显著增加(P<0.05，P<0.01)，5-HT/NE、Glu/GABA数值显著升高(P<0.05，P<0.01)；与模型组相比：地西泮对照组DA、5-HT、Glu、GABA含量显著减少(P<0.05，P<0.01)，NE含量无显著性差异，5-HT/NE、Glu/GABA数值显著下降(P<0.05，P<0.01)；炒酸枣仁对照组5-HT、Glu含量显著性减少(P<0.05，P<0.01)，DA、NE、GABA含量无显著性差异，5-HT/NE、Glu/GABA数值显著下降(P<0.05，P<0.01)；生与炒酸枣仁配伍组DA、5-HT、Glu含量显著减少(P<0.05，P<0.01)，生与炒酸枣仁配伍组NE、GABA含量无显著性差异，5-HT/NE、Glu/GABA数值显著下降(P<0.05，P<0.01)；与地西泮对照组相比，生与炒酸枣仁配伍组DA、5-HT、NE、Glu、GABA含量无显著差异；5-HT/NE、Glu/GABA数值无显著性差异；与炒酸枣仁对照组相比，生与炒酸枣仁配伍组DA 、Glu含量显著减少(P<0.05)，NE、5-HT、GABA含量无显著性差异，5-HT/NE、Glu/GABA数值无显著性差异，见表5～11。

表5 各组对LA脑区24 h NE含量的影响

表6 各组对LA脑区24h DA含量的影响

表7 各组对LA脑区24 h 5-HT含量的影响

表8 各组对LA脑区24 h Glu含量的影响

表9 各组对状态性焦虑大鼠LA脑区全天24 h GABA含量的影响

表10 各组对状态性焦虑大鼠LA脑区24 h内5-HT/NE水平的影响

表11 各组对状态性焦虑大鼠LA脑区24 h Glu/GABA水平的影响

3.4 海马脑区透析样品中NE、DA、5-HT、Glu、GABA含量测定结果及5-HT/NE、Glu/GABA水平变化

在海马脑区中，DA、NE、5-HT、Glu、GABA含量，5-HT/NE、Glu/GABA数值变化如下：与空白对照组相比，模型组大鼠DA、NE、5-HT、Glu含量显著增加，GABA含量显著减少，5-HT/NE、Glu/GABA数值显著增加(P<0.05，P<0.01)；与模型组相比，地西泮对照组大鼠海马脑区DA、NE、5-HT、Glu含量均显著性减少，GABA无显著性差异，5-HT/NE、Glu/GABA数值显著减少(P<0.05，P<0.01)；炒酸枣仁对照组DA、NE、5-HT、GABA含量无明显差异,Glu含量显著性减少，5-HT/NE、Glu/GABA数值显著减少(P<0.05，P<0.01)；生与炒酸枣仁配伍组大鼠DA、NE、5-HT、Glu含量均显著性减少,GABA无显著性差异，5-HT/NE、Glu/GABA数值显著减少(P<0.05，P<0.01)；与地西泮对照组相比，生与炒酸枣仁配伍组DA、NE、GABA含量无显著性差异；5-HT、Glu含量显著性减少，5-HT/NE、Glu/GABA数值显著减少(P<0.05，P<0.01)；与炒酸枣仁对照组相比，生与炒酸枣仁配伍组DA含量显著性减少，NE、5-HT、Glu、GABA含量对比无显著性差异，5-HT/NE、Glu/GABA数值显著减少(P<0.05，P<0.01)，见表12～18。

表12 各组对状态性焦虑大鼠海马脑区全天24 h NE含量的影响

表13 各组对状态性焦虑大鼠海马脑区全天24 h DA含量的影响

表14 各组配伍对状态性焦虑大鼠海马脑区全天24 h 5-HT含量的影响

表15 各组对状态性焦虑大鼠海马脑区全天24h Glu含量的影响

表16 各组对状态性焦虑大鼠海马脑区全天24 h GABA含量的影响

表17 各组对状态性焦虑大鼠海马脑区24 h内5-HT/NE水平的影响

表18 各组对状态性焦虑大鼠海马脑区24 h内Glu/GABA水平的影响

4 讨论

本文采用脑内微透析技术与HPLC-ECD及 HPLC-OPA分析方法相结合，研究生与炒酸枣仁配伍对大鼠脑内神经递质释放的影响。微透析技术[9]可在局部未结合浓度进行采样，从而可以直接将组织浓度与药理作用联系起来，可以以高时间分辨率对一只动物进行重复采样，同时获得更多信息。微透析已被证明是了解未结合目标位点浓度及其与效应关系的一种非常重要的方法。该方法有助于量化药物的主动转运，在理解组织分布和浓度-效应关系-结合数据建模方面对定量系统药理学做出了非常有价值的贡献。但对手术要求较高，有采样量小，样品不易保存等问题。

海马是焦虑发生的重要靶部位，参与应激的发生和转归。在焦虑脑内环路中，海马受到杏仁核调制，进而促进与情绪相关记忆的增强；情绪记忆的编码后加工主要在海马中完成[10-11]。焦虑发生的同时伴有杏仁核功能的改变[12-13]。LA参与情绪的管理，参与防御反应行为和生理机制的整合，通过调制海马促进与情绪刺激相关的记忆。在焦虑脑内环路中，LA直接接受来自皮质层中视觉、听觉区域投射的信息，并传递信息到中央核。各脑区结构之间依靠神经递质传递信息、相互作用，进而调节情绪活动。所以本实验选取LA、海马作为药物作用机制的研究核心，探讨生与炒酸枣仁在状态性焦虑的作用和潜在机制。

结合实验结果可知，生与炒酸枣仁配伍以及炒酸枣仁增加状态性焦虑大鼠在EPM中开放臂停留时间百分比(OT%)和进入开放臂次数百分比(OE%)，二者均具有拮抗大鼠状态性焦虑的作用，且生与炒酸枣仁配伍拮抗大鼠状态性焦虑作用效果强于炒酸枣仁。生与炒酸枣仁配伍可以降低海马脑区中NE、DA、5-HT、Glu的含量。虽然GABA含量升高未见显著性差异，但在给药作用下，GABA含量仍有增加的趋势；5-HT/NE、Glu/GABA数值均显著下降，说明生与炒酸枣仁配伍可以降低海马脑区中兴奋性神经递质含量，通过抑制中枢神经系统兴奋性拮抗焦虑。炒酸枣仁可以降低海马脑区中5-HT、Glu含量和Glu/GABA比值，使海马脑区中GABA含量有增加趋势，但没有显著性差异，含量水平与前人报道基本一致[14-18]。生与炒酸枣仁配伍可以降低LA脑区中NE及DA、Glu的含量，5-HT含量没有显著性变化，但有下降趋势；GABA含量没有显著性变化，但有上升趋势；生与炒酸枣仁配伍显著影响了实验动物LA脑区内Glu/GABA的水平，使其比值水平接近正常值。炒酸枣仁可以降低LA脑区中NE、5-HT的Glu含量、5-HT/NE和Glu/GABA水平,含量水平与前人报道基本一致[19-22]。

本研究表明生与炒酸枣仁配伍，可以拮抗焦虑情绪，其机制可能与调节状态性焦虑大鼠LA、海马脑区中单胺类与氨基酸类神经递质含量有关。本研究为探索生与炒酸枣仁配伍治疗状态性焦虑的机制提供了科学依据。