单核/巨噬细胞在尿源性脓毒血症发病机制中的作用研究进展

杨逸铭 赖良海 关登海 柳建军

脓毒血症(sepsis)是由于机体对外来炎性因子反应失调引起的全身炎性反应综合征，每年全球重症脓毒血症患者高达180万[1]。李恭会等[2]指出尿源性脓毒血症发生率为0.5%～5%，其中脓毒血症性休克患者的病死率为28.3%～41.4%。尿源性脓毒血症起病初期症状不明显、进展迅速、病情凶险、病死率极高[3]。大肠埃希菌是尿源性脓毒血症最常见的革兰氏阴性菌致病菌，主要由其细胞壁上的脂多糖致病(lipopoly saccharide,LPS)[4]。LPS诱导Toll样受体(toll liker eceptors,TLRs)信号通路激活单核/巨噬细胞内信号传导，引起宿主细胞因子失衡、免疫细胞功能改变及调亡，最终可能引起患者休克或死亡[5]。当微生物LPS入侵机体后，首先激活机体的单核/巨噬固有免疫反应，早期爆发性释放使机体的固有免疫和特异性免疫系统使机体发生重要变化，如单核/巨噬细胞功能改变、细胞因子失衡、免疫细胞凋亡等，提示患者已经进入尿源性脓毒血症免疫抑制状态[6]。至今无特效免疫治疗方法，尿源性脓毒血症造成患者多器官功能衰竭需要ICU监护治疗，对患者造成重大经济损失、严重危害患者的生命健康。目前对于尿源性脓毒血症主要在早期诊断、早期干预及有效的对症治疗。因此，对单核/巨噬细胞在尿源脓毒血症机制的研究进行综述。有助于临床治疗尿源性脓毒血症、提高患者生存率提供可靠依据。

1 目前尿源性脓毒血症的研究

尿源性脓毒血症主要是上尿路梗阻引起泌尿系感染，引起梗阻最常见病因是输尿管结石。当宿主固有免疫系统的模式识别病原体或损伤相关分子模式产生促炎细胞因子时，脓毒血症复杂的发病机制就开始了。首先侵入病原体启动先天免疫系统迅速发展适应性免疫系统，最后导致免疫抑制。脓毒血症由第三个国际共识的脓毒症和脓毒性休克(脓毒症-3)定义为“由于宿主对感染的反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍”[7]。但脓毒血症诊断的临床标准在重症医学科之外，qSOFA评分用于败血症三个标准组成：精神状态改变(格拉斯哥昏迷评分)、收缩压≤100 mm Hg和呼吸频率≥22次/min。如果符合≥2项标准，患者被视为高风险患者[8]。但由于尿源性脓毒血症初期症状不明显、病情进展快、病情凶险。所以早期诊断，早期目标导向治疗显者尤为重要，包括血浆和泌尿道中抗菌药物的最佳药效暴露；还要重视尿路并发症的识别和控制，如观察患者血压、呼吸频率、脉搏、肢体温度及神志变化。另外，临床中常用早期感染指标包括有降钙素原(PCT)、白细胞计数、C-反应蛋白(CRP)、血小板、纤维蛋白原、D-二聚体、白细胞介素6等炎性指标[9]。近几年，有学者提出血单核细胞计数的下降与尿源性脓毒血症的发生具有密切关系，早期血单核细胞计数的下降对于早期尿源性脓毒血症的诊断有较大价值[10]。

2 单核/巨噬细胞发育及分布

婴幼儿时期，单核/巨噬细胞大部分来源于骨髓造血干细胞，逐渐发育各时期单核细胞后，进入血流循环定居不同器官组织并有不同的命名。学者提出单核吞噬细胞系统(mono-nuclear phagocyte system,MPS)在机体状态下分布在组织中的巨噬细胞均由单核细胞发育发展而来[11]。单核细胞在免疫系统中是免疫效应细胞，具有分泌炎性因子功能以及表明表达受体分子识别模式。正常机体循环在血液、骨以及肝脾中的单核细胞是不能增殖的[12,13]；机体被感染初期时，单核细胞并在趋化因子作用下从血液循环迁移至感染灶，并在迁移过程中主要分化发育成树突状细胞(dendritic cell，DC)与巨噬细胞。有国外研究发现单核细胞在感染性抗原及受体识别模式作用下迁移并分化成巨噬细胞和DC[12]。随着对巨噬细胞深入研究发现定居外周组织的巨噬细胞具一定增殖与自我更新能力。目前按起源巨噬细胞的可分为由髓系干细胞发育、卵黄囊衍生、自我更新增殖。局部巨噬细胞自我增殖，猜测是一部分骨髓造血干细胞脱离骨髓微环境进入外周组织器官，受到细菌感染、受伤等因素刺激后增殖分化，进一步发育成巨噬细胞[14]。当机体受到感染，单核/巨噬细胞首先诱导、吞噬及消灭外来入侵病原体，进一步释放细胞因子启动免疫反应。

3 单核/巨噬细胞与尿源性脓毒血症促炎期

在尿源性脓毒血症中，宿主主要通过定位于炎性细胞膜和内膜上的Toll样受体(TLRs)。直至今日发现的TLRs有13种，且一种Toll样受体能够识别多种受体的配基。在哺乳动物中，TLR4是识别细菌的脂多糖的主要受体[15,16]，并且TLR4主要表达于巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞等免疫细胞。当内毒素入血后激活患者单核巨噬细胞，提呈抗原及诱导特异性T淋巴细胞活化，起动机体免疫功能。首先微生物内毒素激活激活血浆中结合蛋白(lipopolysaccharide-binding protein，LBP)，其与LBP结合为LPS-LBP复合物。LBP与LPS的结合取决于浓度，最终以LBP介导LPS转运到单核巨噬细胞膜的表面。另外，LBP可以分解LPS为单体并与分化簇14(cluster of differentiation 14，CD14)结合成CD14-LPS-LBP三联复合物。但由CD14没有跨膜区和胞浆内段，CD14-LPS-LBP三联复合物与TLR4结合并转入细胞内。LPS-LBP-CD14三分子复将活化信号传入细胞内。期间需要单核巨噬细胞辅助分子髓样分化蛋白2(myeloid differentiation protein 2，MD-2)的协同作用下，结合形成TLR4-MD-2-LPS复合物，再以对称的方式形成二聚体激活促炎症信号通路[17]。

二聚体形成后，标志着LPS-TLR4-MD-2途径被激活。TLR4通过膜受体Toll/IL-1受体结构域(TIR结构域)和髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)的TIR结构域相结合，它们互相作用后启动细胞内信号传导链。引起下游核因子κB(NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)等活化。其中白介素受体相关激酶(IRAK-1/4)与TNF受体相关因子6(TRAF-6)被激活。在正常情况下，NF-κB与NF-κB抑制蛋白(IκB)形成复合物存在于单核巨噬细胞浆中。当机体受到微生物LPS信号刺激后，引起IRAK-1/4和TRAF-6I活化并作用于κB激酶复合体(IKK)将IκB磷酸化。最终使NF-κB与IκB分解，其中游离的NF-κB激活并通过核膜进入胞核。产生大量的促炎性细胞因子如：TNF-α、IL-6、IL-8等促炎细胞因子。TNF-α和IL-1的产生并在粒细胞集落刺激因子和干扰素γ协同作用下容易使尿源性脓毒性患者休克状态。这些炎性因子相互作用使机体引发瀑布式炎症效应，甚至出现强烈的免疫反应[18]。

单核细胞在尿源性脓毒血症发病机制中还存在MAPK信号通路，MAPK作为丝裂原活化蛋白激酶。在哺乳动物中MAPK信号通路有调节蛋白激酶(ERK-1/2)、p38MAPK、c-JunN端激酶(JNK)通路[19]。当机体受到微生物LPS入侵，MAPK信号通路活化，导致ERK、JNK和p38各级联信息传导，诱导转录因子c-Jun和c-fos活化后转入细胞核形成转录因子AP-1。转录因子AP-1主要功能是调控IL-1、IL-6和TNF-α等促炎性因子的转录释放，从而形成过度性炎性反应损伤机体器官。唐亚纯等[20]研究抑制p38 MAPK信号通路可以减少尿源性脓毒血症兔肾组织细胞凋亡。单核/巨噬细胞在尿源性脓毒血症中的发病机制还包括可溶性髓样细胞触发受体1、胞浆内的NOD样受体、C型凝集素受体、HIN200蛋白等。综述国内外脓毒血症研究进展，将有利于提高早期尿源性脓毒血症的诊断及治疗。

4 单核/巨噬细胞与尿源性脓毒血症免疫抑制期

4.1 单核/巨噬细胞功能改变 在微生物LPS等TLR激动剂以及微生物化合物持续的刺激下，单核/巨噬细胞分泌促炎细胞因子减低，而抗炎性细胞因子逐渐增强。尿源性脓毒血症免疫抑制状态与LPS耐受中的现象有相近之处。单核/巨噬细胞在尿源性脓毒血症免疫抑制期分泌促炎细胞因子TNF家族(TNF-α、TNF-β、Fas)、IL-1、IL-1α、IL-6和高迁移率族蛋白1(HMGB1)等能力下降，但产生IL-10、TGF-β、IL-4、IL-1受体拮抗剂(IL-RA)等免疫抑制因子的释放能力不受损，甚至增强[21]。单核/巨噬细胞的功能并没有完全消除，而只是从促炎性反应模式转变为抗炎性反应模式，这符合了单核/巨噬细胞核基因重新表达的概念[22]。单核/巨噬细胞LPS耐受病理机制主要为编码免疫抑制分子基因表达增加，而表达促炎因子及趋化因子受体基因表达能力下降。免疫抑制分子大量释放以IL-10、TGF-β为主，另外单核/巨噬细胞表面人类白细胞抗原-DR(HLA-DR)表达降低导致抗原提呈至T淋巴细胞能力降低，二者暗示尿源性脓毒症免疫抑制期预示不良。其中IL-10可诱导单核/巨噬细胞抗炎因子分泌加强，同时抑制促炎细胞因子合成；除此之外，IL-10也可以诱导IL-1RA抑制抗原提呈能力，从而增加再次感染的机会。陈冬萍等[23]发现单核/巨噬细胞在尿源性脓毒血症免疫抑制期HLA-DR与共刺激分子CD80/86表达降低、抗原递呈能力下降。我们能够确定这种类型的临床发展与免疫单核巨噬细胞的失活有关。单核细胞上HLA-DR的表达减少到<30%(通常是>80%)，部分单核细胞丧失抗原递呈活性，从而合成促炎细胞因子发挥能力进一步降低。在尿源性脓毒血症免疫抑制期,单核/巨噬细胞功能重建主要是由干扰素-γ(IFN-γ)和重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等因子发挥作用。IFN-γ分泌减少是尿源性脓毒症免疫抑制的关键因素。IFN-γ主要是通过诱导单核巨噬细胞HLA-DR以致恢复单核/巨噬细胞分泌促炎细胞因子。研究表明，GM-CSF不但可以促进尿源性脓毒症患者单核/巨噬细胞HLA-DR的表达，而且促进炎性因子IFN-γ的释放，逆转免疫抑制状态[24]。单核/巨噬细胞功能恢复对尿源性脓毒血症免疫抑制患者至关重要。单核巨噬细胞激活剂进行免疫调节治疗虽然未取得突破性进展，但我们仍可以更好地致力于规划未来的尿源性脓毒血症研究。

4.2 DC与尿源性脓毒血症 DC是由骨髓单核源性细胞分化而来。DC能够吞噬以及分解提呈病原体的抗原，还能够诱导免疫耐受、激活T细胞的特异性免疫反应。DC在固有免疫应答中作为机体防御第一防线，以保护宿主免受入侵感染。尿源性脓毒血症免疫抑制期,淋巴组织和非淋巴组织的树突状细胞丢失，主要是由于细胞凋亡。在对尿源性脓毒血症患者的尸检报告中发现循环和脾脏DC的数量明显减少[15]。更严重的是在尿源性脓毒血症患免疫抑制期DC数量更加减少，存活的DC提呈、传递抗原能力降低。DC在尿源性脓毒血症免疫抑制期分泌HLA-DR水平也逐渐降低，IL-10分泌不受损或增加。在小鼠脓毒血症研究中发现，DC能够明显分泌抗炎细胞因子，有利于小鼠抵制严重性脓毒血症[25]。然而，在微生物LPS刺激TLRs激活MyD88信号通路，增强促炎因子释放。尿源性脓毒血症免疫抑制期发生导致脾脏DC细胞负荷消耗殆尽[26]。DC不但通过诱导效应T细胞，而且能使T细胞调亡以及抑制效应T细胞亚群(Treg)增殖，决定免疫反应类型[27]。有研究发现，通过防止DC凋亡或加强介导DC增殖分化功能，明显提高患者生存率[28]。其中表达Bcl-2的DC在脓毒血症中减少免疫细胞凋亡有重要作用[29]。TLR激动剂或FMS样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)能促进DC细胞增殖以及增强促炎细胞因子释放，同时对单核细胞以及其他免疫细胞的功能也有极深影响[28]。研究DC细胞在尿源性脓毒血症发病中的作用，合理应用DC拮抗剂或者激活剂，是治疗尿源性脓毒血症的一种重要途径。

5 免疫细胞凋亡与免疫细胞影响

随的脓毒血症的进展，特别是脓毒血症抑制期免疫细胞的功能出现大量的损伤甚至调亡。主要包括单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和DC等在机体中大量凋亡，最终导致了机体的免疫抑制出现恶性循环。有文献研究表明预防免疫细胞凋亡可以明显降低脓毒血症患者的死亡率[30]。在尿源性脓毒血症抑制期，单核细胞、巨噬细胞和DC进一步吞噬凋亡细胞，导致无功能的细胞增多，诱导IL-10分泌，导免疫抑制[31]。在哺乳动物中由一类髓系发展有未完全分化、免疫抑制功能特点的早期抑制细胞(MDSC)。MDSC主要包括单核/巨噬细胞、粒细胞、DC的前体等。单核细胞型MDSC可以通过调节活性氧类(ROS)的浓度，从而诱导T细胞抗原受体-ζ链(TCR-ζ)链干扰免疫T细胞发挥正常功能；而粒细胞型MDSC通过提高一氧化氮的浓度及精氨酸酶的活性，破坏下游IL-2受体传导信号通路，进而诱导T细胞凋亡。尿源性脓毒血症促炎因子TNF-α可以诱导单核细胞凋亡，并促进Fas分泌。在JNK信号途径激活后并引起JNK激酶活化,而JNK存在诱导FasL表达促进淋巴细胞凋亡。另外，单核细胞、巨噬细胞、DC表面HLA-DR的表达降低，并且抑制正常T细胞的功能，表现为免疫无应答，更重要的是促进Treg细胞的增殖。其中，促炎因子HMGB1与高级糖化终物(RAGE)受体特异性结合激活细胞内两个不同信号传导通路，其中天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)级联激发巨噬细胞凋亡起决定性作用[32]。在免疫抑制期，中性粒细胞凋亡对正常巨噬细胞凋亡有密切的相关作用。有研究认为，Treg可以经过Fas/FasL途径诱导和增加单核细胞的凋亡，从而激活caspase-8[33]。车頔等[34]发现脓毒血症患者器官损伤与细胞内线粒体功能异常引起细胞凋亡重要联系。对尿源性脓毒血症凋亡机制研究，应用相关拮抗剂或激活剂将有利于阻止尿源性脓毒血症进展及降低患者死亡率。

6 免疫调节治疗在尿源性脓毒血症中的应用

分子生物学科学技术迅速提高有助于感染性微生物分子检测以及尿源性脓毒血症早期确诊。同时，尿源性脓毒血症早期瀑布级联效应和晚期免疫抑制期的重要性进行深入研究，发现免疫调节治疗明显降低严重脓毒血症患者死亡率并且治疗重点，已经从抑制炎性反应的抗炎调节转变为免疫增强治疗。目前主要通过利用细胞炎性因子、白细胞分化抗原、拮抗炎性介质、内毒素抗体、小分子化合物、抗TLR等进行免疫调理，改善脓毒血症免疫抑制，如应用GM-CSF、IFN-γ增强免疫细胞功能；IL-7、IL-15减少免疫细胞凋亡等。同时，国外研究发现大麻素受体2在脓毒血症降低免疫细胞的激活和抑制促炎因子释放[35]。有效使用大麻素受体2激动剂能减少外周血中IL-6，提高中性粒细胞活性和增强p38活力。以此同时，多黏菌素B固定纤维(PMX-F)治疗尿源性脓毒血症患者明显降低Treg数量和血清中IL-6和IL-10水平[36]。除此之外，TRIM59参与NF-κB信号传导并可促进巨噬细胞的吞噬功能，但TRIM59在脓毒症中的作用尚不清楚。实验的研究还是存在一定价值。研究首次证明TRIM59通过调节巨噬细胞的炎症和吞噬作用保护小鼠免于脓毒血症[37]。免疫调节治疗虽然有了一定的疗效，但其治疗效果仍未得到多中心实验的证实，且免疫调节治疗药物昂贵，患者经济负担较重。

7 结语与展望

尽管尿源脓毒血症机制非常复杂，单核/巨噬细胞在脓毒血症病理进程中的重要作用。脂多糖诱导机体固有免疫与特异性免疫和发生免疫紊乱。近年来，国内外研究发现针对脓毒血症中淋巴细胞功能异常的药物广泛应用于临床，比如胸腺五肽能诱导淋巴细胞增殖,分化成熟,并增加抗原提呈细胞活性[38]，胸腺肽α1促进促炎因子与抗炎因子平衡等。这些药物对阻止脓毒血症病程的发生发展有显著的效果。尿源性脓毒血症的诊断非常重要的。单核/巨噬细胞在脓毒血症发生中起启动固有免疫作用。单核/巨噬细胞计数变化在发生脓毒血症早期中可能存在一定诊断价值。给治疗尿源性脓毒血症诊断及治疗提供新思路。在临床中，针对尿源性脓毒症发病机制不同免疫阶段使用有效的免疫药物治疗提供依据。